蛋白质的性质实验原理和操作步骤-1-2
2. 不可逆的沉淀反应
在发生沉淀反应时，蛋白质的分子内部结构，空间构象遭到破坏，失去其天然蛋白质的性质，这时蛋白质已发生变性。变性后的蛋白质沉淀不能再溶解于原来的溶液中，这种沉淀反应称为不可逆沉淀反应。重金属盐、生物碱试剂、过酸、过碱、加热、震荡、超生波、有机溶剂等都能使蛋白质发生不可逆沉淀反应。
重金属盐类易与蛋白质结合成稳定的沉淀而析出。蛋白质在水溶液中是酸碱两性电解质，在碱性溶液中（对蛋白质等电点而言），蛋白质分子带负电荷，能与带正电荷的金属离子，如Zn2+、Cu2+、Hg2+、Pb2+
、Fe3+结合成蛋白质盐。在有机体内，蛋白质常以其可溶性的钠盐或钾盐存在，当加入汞、铅、铜、银等重金属盐时，则蛋白质形成不溶性的盐类而沉淀。经过这种处理后的蛋白质沉淀不再溶解在水中，说明它已发生了变性。重金属盐类沉淀蛋白质的反应通常很完全。因此，生化分析中，常用重金属盐除去体液中的蛋白质;
临床上则用蛋白质解除重金属盐食物性中毒。但应注意，过量的醋酸铅或硫酸铜可使沉淀的蛋白质再溶解。
蛋白质在有机酸的作用下带正电荷，与酸根的负电荷结合成为溶解度很小的盐类而沉淀。三氯乙酸和磺基水杨酸最有效，可将血清等生物体液中的蛋白质完全除去，因此得到广泛应用。
【实验试剂和器材】
（一）试剂
1. 卵清蛋白溶液：取5ml鸡蛋清，用蒸馏水稀释至100ml，搅拌均匀后用4—8层纱布过滤,新鲜配制。
2. 0.5% 酪蛋白(以0.01N NaOH作溶剂)
3. 酪蛋白-醋酸钠溶液：称取纯酪蛋白0.25克，加蒸馏水20ml及1.00N NaOH溶液5ml
(必须准确)。摇荡使酪蛋白溶解。然后加1.00N醋酸5ml ((必须准确)，倒入50ml
蒸馏瓶内，用蒸馏水稀释至刻度，混匀，结果是酪蛋白溶于0.10N醋酸钠溶液内，酪蛋白的浓度为0.5% 。
4. 蛋白质-NaCl溶液: 取20ml蛋清,加蒸馏水200ml和饱和氯化钠溶液100ml，充分搅匀后，以纱布滤去不溶物（加入氯化钠的目的是溶解球蛋白）。
5. 0.5% 甘氨酸，0.3% 酪氨酸，0.5% 色氨酸
6. 尿素，双缩脲试剂，0.1%茚三酮乙醇溶液，浓硝酸，10%NaOH
7. 0.01%溴甲酚绿指示剂，0.02N HCl，0.02N NaOH，0.01N HAc，0.10 N HAc，1.00N HAc
8. 饱和硫酸铵溶液, 硫酸铵粉末, 2%硝酸银, 0.1%硫酸铜, 饱和硫酸铜, 10%三氯乙酸,
（二）器材
试管及试管架，酒精灯，玻璃漏斗，滤纸，移液管，滴管，恒温水浴。
【实验方法】
1. 双缩脲反应
取少量尿素结晶，加入干燥试管中。用微火加热使尿素熔化。熔化的尿素开始硬化时，停止加热，尿素放出氨，形成双缩脲。冷后加入10滴双缩脲试剂，混匀, 观察颜色变化。
另取1支试管，加入卵清蛋白溶液 1ml 再加入5滴双缩脲试剂，混匀，观察颜色变化。
2. 茚三酮反应
取 2 支试管，分别加入卵清蛋白溶液和0.5%甘氨酸溶液4滴 ，再加入2滴0.1% 茚三酮乙醇溶液，混匀，在沸水浴中加热 1-2 分钟，观察颜色变化，并比较蛋白质和氨基酸呈色深浅。
3. 黄色反应
按下表分别向 6 支试管中加入试剂，微火小心加热(不必沸腾)，观察颜色变化。再滴加 10% NaOH 溶液使呈碱性，观察颜色变化.
4. 蛋白质的两性反应
（1） 取 1 支试管，加入1ml 0.5% 酪蛋白和5-7滴 0.01% 溴甲酚绿指示剂（变色范围是pH 3.8—5.4，在酸性溶液中为黄色，在碱性溶液中为蓝色），混匀，观察溶液的颜色。
（2）用滴管缓慢加入 0.02N HCl 溶液，随加随摇，直到有大量沉淀产生。说明原因，并观察溶液颜色的变化。
（3）继续滴入 0.02N HCl 溶液，观察沉淀和溶液颜色的变化，说明原因。
（4）再缓慢滴入 0.02N NaOH 溶液，观察沉淀和溶液颜色的变化过程，说明原因。
5. 酪蛋白等电点的测定
取 9 试管编号后按下表顺序准确加入试剂。加入每种试剂后应混匀。（单位：ml）
静置约20分钟,观察每支试管内的混浊度,以-,+,++,+++,++++符号表示沉淀的多少。根据观察结果，指出哪个pH是酪蛋白的pI。
