原位杂交法测定TNF的mRNA
实验概要
本实验用原位杂交法测定了TNF的mRNA。
主要试剂
1. 原位杂交
1) TNF-DNA探针
2) 地高辛标记液试剂盒
3) 杂交液：60%去离子甲酰胺，300mmol/L NaCl、30mmol/L柠檬酸钠、10mmol/L EDTA 25mmol/L NaH2PO4(pH7.4)，5%葡聚糖硫酸酯，250μg/μl变性鲑精DNA
2. 洗涤
1) 2×SSC：1000ml蒸馏水中加氯化钠17.6g，柠檬酸三钠(C6H5O7NA3·2H2O，分子量294)8.8g
2) 0.5×SSC：300ml蒸馏水加100ml 2×SSC即可
3) 0.2×SSC：270ml蒸馏水加30ml 2×SSC即可
3. 荧光抗体检测
1) 封闭液：Tris-HCl 100mmol/L PH7.5，NaCl 150mmol/L，0.5%羊血清。
2) 抗DIG-荧光素抗体
3) 洗涤液：0.1M，pH7.2～7.4PBS。
4) 20%甘油：20ml甘油加80ml蒸馏水即可。
5) 乙醇：70% 90% 100%
6) 防退色溶液：九份甘油与一份染液(1mmol/L Tris-HCl pH7.5，2% 1.4-diaza-bicyclo[2，2，2]-Octane，500ng/ml propidiumiodide)
7) 地高辛标记和检测试剂盒
主要设备
1. 原位杂交
温箱，水浴锅，加样器，吸头，染色缸等
2. 荧光抗体检测
加样器，吸头，染色缸等
实验步骤
1. 原位杂交
1) 用地高辛标记DNA探针；
2) 准备杂交液；
3) 临用前，将DIG标记的DNA探针在80℃加热10分钟，迅速置冰浴中变性后，将其加入杂交液中，至终浓度5μg/μl；
4) 将10-20μl杂交混合液(杂交液加变性探针)加入到固定并增加了通透性的细胞上，盖上专用原位杂交盖玻片，放入盛有约20ml 20%甘油湿盒内37℃使其杂交过液。
2. 洗涤
揭掉盖玻片，30-37℃左右水温的2×SSC洗涤5min×2次，0.5×SSC洗涤15min×1次，0.2×SSC洗涤15min×1次。
3. 荧光抗体检测
1) 每块载玻中上加100μl封闭液，封闭非特异性结合位点；
2) 用封闭液将抗DIG-荧光素抗体按1：500稀释加在载玻片上，置湿盒内37℃温育45min，用洗涤液洗5min×4次；
3) 用100mol/L Tris-HCl(pH7.5)，150mmol/L NaCl，0.05% Tween 20洗载玻片；
4) 将细胞样品依次在70%，90%，100%乙醇浸泡5分钟，脱水；
5) 将玻片在空气中干燥；
6) 将细胞样品放在防退色溶液中，取出封片。
