平滑肌细胞培养方法-2
1 材料与方法
1.1 材料 9~12d新生健康清洁级KM小鼠，雌雄不限，购自重庆医科大学实验动物中心。RPMI-1640干粉培养基，D-Hanks粉，标准胎牛血清，胰蛋白酶粉（1∶250）均购自Hy-Clone公司；青霉素钠、硫酸链霉素购自华北制药厂；鼠抗兔平滑肌α肌动蛋白单克隆抗体，购自Zymed公司；SP免疫组化试剂盒，DAB显色试剂盒购自北京中山生物技术公司。
1.2 细胞培养 断颈处死小鼠，75%乙醇浸泡消毒2min，分离取出胸主动脉，D-Hanks液清洗去除血污，获干净光滑的血管段，用眼科镊固定血管段端，刀片轻刮去外膜结缔组织，再用眼科剪小心剖开血管，刮去内膜层细胞，将血管段剪成1mm×1mm大小的组织块，均匀贴放于25ml培养瓶底面，组织块间隙约2~3mm，加入含10%胎牛血清的1640培养液2~3ml，轻晃培养瓶使培养液掠过组织块，翻转静置于37℃、5%CO2培养箱中3~4h，再次翻转培养瓶使组织块浸没于培养液中，半开放式绝对静置培养3d，4~5d时首次换液。当组织块周围外长的细胞相互汇合，逐渐铺满整个瓶底时，需进行首次传代：吸弃旧培养液，D-Hanks液2ml清洗后吸弃，加0.25%（g/L）胰酶液2ml在37℃下消化，2~5min后镜下观察，当细胞回缩、间隙增大时，吸弃胰酶液，加入含10%胎牛血清的1640培养液4~6ml终止消化，反复吹打瓶壁细胞，形成的细胞悬液按1∶2接种（消化后脱落的组织块可一并传入新培养瓶中）。以后的传代方法相同，传代周期为5~7d。
1.3 细胞纯化
1.3.1 自然纯化法 由于进行了前期的血管预处理（去除了大部分内膜和外膜组织），原代培养时虽为多种细胞混杂生长，但平滑肌细胞仍占绝大多数。随着传代次数的增加，平滑肌细胞可排挤其它细胞的生长而优势增殖。
1.3.2 机械刮除法 虽然去除了大部分内膜组织，但培养中仍可见内皮细胞的小范围生长。传代前在镜下用记号笔在培养瓶表面划出内皮细胞生长区域，用弯头吸管在该区域内反复推刮、破坏细胞，吸弃培养液后再进行传代。
1.3.3 差异贴壁法 残留的内膜和外膜组织中含有少量的成纤维细胞，参阅李悦梅等[1]的方法去除：传代时，将消化吹打形成的细胞悬液静置15min，使部分细胞贴壁，转移培养液至下一个培养瓶中，再次静置、贴壁，重复上述步骤1~2次，最后一个培养瓶中可获较纯的平滑肌细胞。（根据不同细胞贴壁的时间差纯化细胞）
1.4 细胞鉴定
1.4.1 形态学观察 应用倒置相差显微镜观察细胞大小、形态、生长特点及排列方式等。
1.4.2 免疫细胞化学染色 将第5代对数生长期的细胞悬液接种到预先放置2张7mm×22mm盖玻片的培养瓶中，培养2~3d后，取出盖玻片，PBS漂洗5min×3次，4%多聚甲醛室温下固定20~30min，PBS再次漂洗5min×3次，然后按照SP免疫组化试剂盒和DAB显色试剂盒说明书逐条进行操作（一抗是鼠抗兔平滑肌α肌动蛋白单克隆抗体）。
细胞培养的几点技巧：①相同条件下，小龄动物较大龄动物的组织块有更好的增殖潜能，但动物体积过小又存在取材困难，组织量少的问题，采用9~12 d新生小鼠取材，既能对血管进行顺利操作，又能保证约90%的组织块有细胞外长。②细胞生长具有接触抑制和密度依赖性，一般取2~3只小鼠的胸主动脉组织块均匀接种于25 mL培养瓶中，间隙约2~3 mm。当部分组织块周围细胞密集、重叠，停止增殖时，即使整瓶细胞未达到传代标准，仍可用酶消化，吹散密集细胞，1∶1方式传代生长。③原代培养初期，当部分组织块漂浮未贴壁，可将其重新摆放至瓶底，翻转干涸2~3 h后，再浸没于培养液中，使其重新贴壁。该法不会影响同瓶中其他已萌出细胞的生长。④小鼠主动脉极细，操作时动作一定要轻柔，避免对血管的过度损伤。一般受牵拉少，剪切时边缘整齐圆滑的组织块萌出细胞的概率较大。⑤细胞传代时，酶消化时间不应固定或硬搬他人经验，应在镜下观察，至胞质回缩，间隙增大时及时终止消化。
细胞原代培养的常用方法有酶消化法和组织块法，酶消化法培养周期短，但酶作用时间不易掌握，且消化酶本身对培养细胞有毒性作用，可致培养失败；组织块法虽培养周期相对较长，但操作简便，污染机会小，培养效率高。本研究中由于新生小鼠主动脉细小，可供培养的组织量少，于是采用了组织块培养法。
07滨州医学学报 改进的脐动脉血管平滑肌贴块培养法
用DMEM培养液反复冲洗，以去掉血管内外的血迹，用眼科镊小心分离下动脉外的结缔组织及血管外膜，然后用眼科剪纵向剪开血管，再用眼科剪将中膜和内膜剪成约1~2 mm2大小的组织块，用弯头吸管将血管小块移入25 cm2塑料培养瓶，并以4~7块/cm2的密度均匀排列于培养瓶底（培养瓶底提前用培养液湿润），翻转后加入含有青霉素和链霉素及20%胎牛血清的DMEM培养液约3~5 m，l放入37℃、5%CO2培养箱内（湿度100% ），贴壁2~3 h后再轻轻翻转培养瓶，使组织块浸入到培养液中，开放式培养，一周后取出观察并换液。
1.2.2 胎儿脐动脉血管平滑肌细胞的传代培养：细胞生长融合后，用0.125%的胰蛋白酶消化传代。先将胰蛋白酶放入37℃水浴箱预热。用吸管将组织块从培养瓶底轻轻吹打下来，可以将组织块重新移入另一培养瓶继续贴块法培养。用无血清的培养液将培养瓶底冲洗两遍，洗掉残留的血清，然后迅速加入预热的胰蛋白酶，放回培养箱，每隔2 min观察一次，并轻轻拍打培养瓶壁，使细胞从瓶底脱落下来，待镜下观察多数细胞收缩变圆后，向培养瓶中加入含血清的培养液，终止胰蛋白酶的作用，再用吸管轻轻吹打培养瓶底，使细胞脱落，然后将培养瓶中的液体移入离心管，500 r/min，离心10 min后，弃上清液，然后加入含有10%胎牛血清的培养液将沉淀制成均匀的细胞悬液，按1∶2的比例将细胞悬液移入培养瓶，放回培养箱继续培养。
1. 2.3 血管平滑肌细胞的鉴定
取常规传代的细胞，制成均匀的细胞悬液后，移入放有盖玻片的培养皿中培养，待细胞贴壁伸展，生长良好后取出盖玻片，用PBS冲洗2遍，凉干，放入4%的多聚甲醛中固定，30% H2O21份+纯甲醇50份混合，灭活内源性过氧化物酶，然后热修复抗原，再分别滴加5%BSA封闭液、一抗[即抗平滑肌α-肌动蛋白（α-actin）的单克隆抗体]、生物素化山羊抗小鼠IgG、试剂SABC，最后DAB显色，苏木素复染，酒精梯度脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，显微镜下观察。
