平滑肌细胞培养方法-3
2 结果
2.1 体外培养的胎儿脐动脉血管平滑肌细胞的形态观察 实验中观察到脐动脉组织块贴壁后5~7d可见有细胞以垂直方向从组织块周围游走出来（见图1），但并不是所有的组织块周围都有细胞游出，离组织块较远的区域也可以看到细胞，此为平滑肌细胞的漂移性生长特性（见图2），细胞形态多样，大小不一，多为长梭形、菱形或星形； 9~11 d细胞进入对数生长期，细胞生长加速，部分区域可见“峰-谷”样生长（见图3）；约2周左右细胞融合成片，甚至相互交叉生长形成多层可以进行传代培养。细胞用胰蛋白酶消化后呈圆形，传代接种于培养瓶4 h就有细胞贴壁，24 h后细胞伸展，细胞形态多样，胞浆丰富，仍然呈“峰-谷”样生长特性，细胞生长较快，5~7 d长满瓶底，可以进行传代。
本实验取材于脐动脉，采用贴块法成功培养出平滑肌细胞。脐动脉是中动脉，中膜中唯一的细胞是平滑肌细胞，内膜中唯一细胞的是内皮细胞，实验中只去除血管外膜，保留中膜和内膜，将中膜和内膜一起培养，摒弃了传统平滑肌细胞培养实验中单纯培养动脉中膜的模式，将平滑肌细胞和内皮细胞联合培养，不但节约了接种时间，而且减轻了对平滑肌细胞的机械损伤，更有利于原代细胞的游出。本实验将去掉内膜的组织块与未去掉内膜的组织块同时培养，比较发现，未去掉内膜的组织块首先游走出细胞，而去掉内膜的组织块生长周期很长，甚至组织块死亡，没有细胞游出。在原代培养时，可以看到内皮细胞从组织块中游走出来，但随着原代培养的进行，内皮细胞不断的被平滑肌细胞所覆盖，又因在传代过程中，内皮细胞处于最底层而不易被消化下来，所以内皮细胞被淘汰，平滑肌细胞得到纯化。另外，脐动脉为中动脉，内膜中的内皮是单层扁平上皮，很薄，只由一层内皮细胞组成，而中膜较厚，由10~40层环行排列的平滑肌细胞组成，显然，平滑肌细胞的数量占有绝对优势；而且参考相关资料和文献[6，7]，发现内皮细胞的培养大多数用酶解法，没有用贴法的，因此，不用担心此方法培养平滑肌细胞会被内皮细胞污染。
实验中发现，平滑肌细胞对温度要求特别严格，培养箱内的温度必须为（37±0.5）℃，而成纤维细胞在（35±0.5）℃就可以生长。另外，在原代培养中组织块的密度要尽量大，因为组织块之间可以产生微量的相互作用；而且所用的眼科剪必须锋利，以减少对组织块的机械损伤，还可以保持组织块周围的整齐，利于细胞游走出来。在原代培养换液时，为避免将组织块晃动下来，可以先将培养瓶翻转过来，换液完成后再将培养瓶翻转。在传代时，必须把胰蛋白酶的温度控制在37℃，使其活性最大，保证最大程度地把细胞消化下来。
06 江西医药 平滑肌细胞培养的综述
2.1平滑肌细胞培养技术
有文献认为组织块+酶消化法，能够缩短培养时间，更易获得大量较纯的原代细胞，方法是：将剪碎的平滑肌组织块用0.1%胶原酶37℃消化0.5～1h后，再接种于培养瓶壁上，37℃培养箱中静置2～4h，待组织块贴壁牢固后，再补加含胎牛血清的培养液，37℃继续静置培养。此种方法细胞游出贴壁时间比传统组织块法短1～2d，可能是由于组织块被胶原酶消化后其细胞间质变得疏松，细胞容易挣脱间质束缚而萌出的缘故[6] （唐槐静，段胜仲，等。胎儿动脉平滑肌细胞培养方法的研究。湖北医科大学学报，1999，20（2）：89）
2.2平滑肌细胞的生物学特性
2.2.1平滑肌细胞生长过程：不同种类的平滑肌细胞培养具有相似的生长过程。贴块法培养的平滑肌细胞，3～7d开始以垂直方向从组织块边缘迁移萌出；6～7d细胞进入对数生长期；7～10d当组织块中大部分细胞萌出后，组织块便自行脱离，其周围细胞密度更加增大，部分区域细胞相互接触交替生长，出现“峰-谷”结构（峰：即多层细胞丘，可达8～10层，谷：即稀疏排列的单层细胞处，甚至无细胞处），这是平滑肌细胞的特征性生长表现；10～14d细胞相互融合。传代细胞的生长特性与原代细胞基本相同，细胞传代的间隔期一般为6～9d，传代开始时细胞呈圆形，不透明，边缘清楚，而后逐渐伸展贴壁，透明度增高，周界不清，呈典型“峰-谷”样生长。
酶消化法培养的平滑肌细胞，培养1d后，大部分细胞已贴壁，换液后继续培养3d，贴壁细胞完全伸展，多数呈长梭型，细胞伸出较长的突起相互接触，部分区域可见典型的“峰-谷”结构，培养7～9d细胞铺满瓶底。培养细胞达铺满状态所需时间与细胞活力和细胞接种密度有关，细胞活力愈大，接种密度愈大，达到铺满状态所需时间愈短。
2.2.2平滑肌细胞形态学特征：许多研究证实，体外培养的平滑肌细胞具有与体内平滑肌细胞相同的形态学特征。倒置显微镜下观察细胞形态，未贴壁前细胞呈圆形或椭圆形，胞质密度高，不透明，胞核多为卵圆形，有多个核仁，贴壁后细胞胞质透明，彼此融合在一起，细胞呈梭形或多角形，核居中央，呈椭圆形。透射电镜下观察，细胞呈不规则形态，核呈锯齿状，胞浆内含平滑肌细胞特征性结构肌丝和密体，粗面内质网扩张，游离核糖体丰富，基膜下有密斑。扫描电镜下可见细胞呈带状，平行排列，细胞周边常发出许多丝状突起与相邻细胞的丝状突起交织成网状。此外，在细胞表面还可见许多疏密不等的小泡，可能为平滑肌细胞收缩运动时胞浆外突的形态表现。
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