平滑肌细胞培养方法-4
动脉平滑肌细胞培养的几个问题
组织块大小边缘密度翻面时间观察时间对原代细胞萌发的影响
对于贴块法的原代培养来源，由于细胞并非直接获得，而是从组织块边缘长出，其中有一“突破过程”，且细胞萌发后尚需一定的细胞密度才能使其存活、增殖，故组织块大小、边缘、密度均影响细胞萌出与否及细胞存活、增殖。公认的方法是将血管剪成1 mm2大小组织块[1~3]。张映娜等认为组织块0.5~2 mm2范围内，大小影响不大（可调整翻瓶时间以保证组织块贴壁）[4]。但如组织块超过2 mm2将增加细胞萌出的阻力。而组织块边缘整齐、光滑、密度
亦对细胞生长起着重要作用。组织块边缘过度受损或毛糙不平及组织块密度过稀或重叠将使细胞很难萌出。作者认为剥除内膜、外膜时用力适中，避免机械拉伤，将镊子夹过处切去，剪切时力求一次剪断。切组织块时不要离开培养液操作，保持边缘湿润，组织块密度以中瓶（100 ml）铺放取自6~8只150~250 g大鼠胸主动脉剪碎组织为宜，而小瓶（70 ml）则以3~4只为佳，且相同重量的大鼠，以月龄较小者为优。翻面时间一般认为3~6 h，具体时间应根据上述影响因素摸索而定。一般5~7 d后观察可见细胞从组织块边缘呈放射状长出，但5 d内不宜移动，以免贴壁的组织块脱落，脱落的组织块很难有细胞的萌出。
适宜的消化
一般认为细胞传代消化以细胞成片收缩，变圆变亮，细胞间隙增大时为宜。它主要取决于胰蛋白酶的浓度，pH值、温度、作用时间，而各实验室报道不一[5~7]。过高浓度的胰蛋白酶达到适宜标准的时间短，仅数十秒，不易控制，易使消化过度，浓度过低达到适宜标准的时间过长，易严重损伤细胞膜，细胞难以贴壁。通过实践摸索，作者认为加入0.05%胰蛋白酶和0.02%的EDTA混合液在温箱内孵育2~3 min即可达到合适的消化度，0.03%的胰酶和0.02%的EDTA混合液亦可达到同样效果，需及时取出观察，终止消化。实验中还应根据传代后死细胞多少而做适当调整。作者通过对大鼠主动脉平滑肌细胞培养的长期摸索与实践，优化培养方法，使组织贴块法更经济实用，为研究提供大量遗传性质均一、功能状态良好的细胞。
第一次传代时机
一般的培养方法是选取细胞达亚融合状态时进行传代[1~3]。但贴块法原代培养时细胞生长往往不均匀，经常是一些区域已长成致密细胞层，一些区域仍未见细胞生长，这种情况下，当整瓶细胞达亚融合时，致密细胞层已老化。作者通过摸索，认为当原代培养5~7 d后可移出孵箱观察，如培养液变黄可部分换药继续培养，每隔2 d观察一次。瓶中若有部分区域达到亚融合状态即可传代，或到10 d左右仍未达到亚融合状态，但达到50%左右融合亦可进行传代，为保证传代细胞密度可将细胞传至小体积培养与封闭培养相结合。
07 中医儿科杂志
1.2 细胞培养方法
1.2.1原代培养
Wistar大鼠20只，断颈处死后，浸泡在75%酒精中5 min，移入超净工作台，在无菌盒盖上迅速取
出心肺组织与胸主动脉，在含青霉素100 U/mL、链霉素100μg/mL的无菌PBS液的培养皿中，冲洗2次，迅速分离出主动脉和肺动脉，并仔细剥除纤维层和外膜。更换培养皿，用眼科剪沿纵行剖开，内膜面向上，用眼科弯剪自上而下轻刮2～3遍，以去除内皮细胞。然后再换培养皿，加1滴DMEM，反复剪切成1 mm3小块（剪切10 min左右）。每只大鼠血管组织块可接种3个25 mL培养瓶，瓶内加入3 mL含20%新生牛血清、青霉素100 U/mL、链霉素100μg/mL的DMEM培养液，翻转湿润瓶底，然后瓶底向上，用尖吸管从培养皿粘吸出小组织块，摆放在培养瓶底，小块相互间距离以0.5 cm为宜。轻翻转培养瓶，令瓶底向上，置于37℃、5%CO2培养箱3～5 h，使小块微干涸；然后轻轻翻转培养瓶，令瓶底向下，让培养液慢慢覆盖于瓶底上的组织小块，置培养箱中静置培养，3 d换1次培养液[1]。
1.2.2传代培养
待原代培养的细胞从组织块长出，数量增加至细胞长满瓶壁或占瓶壁60%～80%时，即可进
行传代培养。吸弃原培养液，向培养瓶中加入PBS液洗净残留培养液，加0.125%胰蛋白酶2 mL，在室温中将培养瓶放于倒置显微镜下观察。待细胞回缩变钝变圆、细胞间隙增大后，立即直立或翻转培养瓶，吸除消化液，用含10%新生牛血清的培养液终止消化，用尖吸管反复吹打瓶壁细胞，使之脱落瓶壁并形成细胞悬液，再分装接种入培养瓶，根据细胞密度按1：2或1：3分装，3 d换液1次，4～6 d再传代。
07中国心血管病研究杂志 大鼠胸主动脉平滑肌细胞的培养与鉴定
1材料与方法
1.1材料SD大鼠体重90～120 g，雌雄不限，购于华中科技大学同济医学院实验动物中心。DMEM高糖培养基、新生牛血清购于美国GIBCO公司，胰蛋白酶购于美国Sigma公司，平滑肌肌动蛋白、SP-9000免疫组化染色试剂盒购于北京中杉金桥生物技术有限公司，其余试剂均为国产分析纯。
1.2方法
1.2.1原代培养颈椎脱臼处死大鼠，75%乙醇浸泡5 min，超净工作台内开胸取胸主动脉，置于含有预冷PBS的培养皿中去除血污，获取干净光滑的血管段，去除外膜与内膜。在另一含少量培养液培养皿中，将中膜剪成1 mm2大小的组织块。用吸管将组织块贴于培养瓶底面，组织块间距2～3 mm。加20%新生牛血清的培养液2～3 ml，将培养瓶直立于37℃、5%CO2培养箱中，待4～6 h后组织块与培养瓶黏附后，平置培养瓶，4～5 d后首次换液。
1.2.2换液方法
细胞换液主要根据细胞生长状况及培养液的颜色变化决定。当细胞增殖旺盛，培养液由桃红色变成黄色时，需换液。弃去旧培养液加PBS液2 ml清洗后吸弃，再加入适量新鲜培养液，也可进行半量或2/3量换液。
1.2.3传代方法
弃去旧培养液后，PBS液清洗2次。向瓶内加入适量的0.25%胰蛋白酶液，在倒置显微镜下观察，当胞质回缩、细胞间隙增大时，加含血清的培养液迅速终止消化。弃去瓶内液体，加入含10%新生牛血清的DMEM培养液反复吹打瓶壁细胞，计数后分别接种到新的培养瓶内。
