DNA酶切问题集锦
我们在进行分子生物学实验，常需要对DNA片段进行酶切。在此，我们对酶切实验中遇到的一些问题做了相应归纳。
带型 | 原因 | 结果分析 |
DNA完全没有被内切酶切割 | 内切酶失活 | 标准底物检测酶活性 |
DNA不纯，含有SDS，酚，EDTA等内切酶抑制因子 | 将DNA过柱纯化，乙醇沉淀DNA | |
条件不适（试剂、温度） | 检查反应系统是否最佳 | |
DNA酶切位点上的碱基被甲基化 | 换用对DNA甲基化不敏感的同裂酶酶解，重新将质粒DNA转化至dcm-，dam-基因型的细菌菌株 | |
DNA酶切位点上没有甲基化（如Dpn I） | 换用不同切割非甲基化位点的同裂酶消化DNA（如San3A I代替Dpn I)，重新将质粒转至dcm+ dam+菌株中扩增 | |
DNA位点上存在其它修饰 | 将DNA底物与λDAN混匀进行切割验证 | |
DNA不存在该酶识别顺序 | 换用其它的酶切割DNA或过量酶消化进行验证 | |
DNA切割不完全 | 内切酶活性下降 | 用5-10倍量过量消化 |
内切酶稀释不正确 | 用酶贮藏液或反应缓冲液稀释酶 | |
DNA不纯，反应条件不佳 | 用酶贮藏液或反应缓冲液稀释酶 | |
内切酶识别的DNA位点上的碱基被甲基化或存在其它修饰 | 用酶贮藏液或反应缓冲液稀释酶 | |
部分DNA溶液粘在管壁上 | 反应前离心数秒 | |
内切酶溶液粘度大，取样不准 | 将内切酶稀释，增大取样体积 | |
酶切后DNA粘末端退火 | 电泳前将样品置65℃保温5-10分钟，取出后置冰浴骤冷 | |
由于反应溶液、温度、强烈振荡使内切酶变性 | 使用标准反应缓冲液及温度，避免强烈振荡 | |
过度稀释使酶活性降低 | 适当稀释酶液，反应液稀释的酶不能贮藏 | |
反应条件不适 | 使用最佳反应体系 | |
识别位点两侧插入了可影响酶切效率的核酸顺序 | 加大酶量5-10倍 | |
DNA片段数目多于理伦值 | 内切酶星状活 | 检查反应条件：甘油浓度大于12%，盐度过低，Mn2+的存在及酶：DNA值过大均均可导致星状活性，降低酶的用量 |
其它内切酶污染 | 用λDNA作底物检查酶切结果 | |
底物中含其它DNA杂质 | 电泳检查DNA，换用其它酶切，纯化DNA片段 | |
酶切后没有观察到DNA片段存在 | DNA定量错误（如RNA含量较高） | 用RNA酶A（无DNA酶）100ug/ml消化DNA样，酚抽提后沉淀溶解，定量 |
在酶切反应液中形成非特异的沉淀 | 在反应前透析DNA样品或用酒精沉淀二次 | |
内切酶保存期内快速失活 | 保存温度不合适 | 内切酶贮藏在含50%甘油的贮藏液中，应在-20℃低温保存 |
以稀释形式保存 | 稀释酶液不宜长期存放，应一次使用 | |
贮藏缓冲液不适当 | 使用厂家推荐的贮藏缓冲液 | |
低蛋白浓度 | 内切酶与500ug/ml的BSA一起保存 | |
电泳DNA片段带型弥散不均 | DNA上结合有蛋白质 | 电泳前上样液65℃加热5min，并加入0.1%的SDS，酚/氯仿抽提纯化 |
内切酶中含有DNA外切酶 | 减少酶用量或消化时间，换用新包装的酶 | |
酶切后的DNA片段连接效率低 | 含磷酸盐的浓度高 | 透析，乙醇沉淀去除磷酸盐 |
内切酶失活不全或含有ATP酶 | 延长灭活时间或用酚抽提，乙醇沉淀回收DNA | |
平末端连接 | 加大T4 DNA Ligase用量 | |
外切酶污染 | 减少酶用量，缩短保温时间，酚抽提回收DNA | |
连接缓冲液不合适 | 重新配制连接缓冲液 |
