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质粒DNA的双酶切

2019.4.23

实验概要

掌握质粒DNA双酶切的原理和操作方法。

实验原理

分子生物学实验中，基因的重组与分离涉及到一系列的酶促反应。许多种酶在基因克隆实验中有着广泛的用途。
限制性内切酶是一类能识别双链DNA分子特异性核酸序列的DNA水解酶。多种细菌能合成限制性核酸酶，这是它们保护自己，降解外来DNA分子的重要手段。每一种内切酶能识别DNA分子中由4～6个核苷酸组成的特定序列。而细菌细胞内的DNA则由于相应序列上的A或C碱基的甲基化而不被攻击，可是外源DNA一旦进入细胞立即被识别，双股DNA螺旋都被切断。限制性内切酶是体外剪切基因片段的重要工具，所以常常与核酸聚合酶、连接酶以及末端修饰酶等一起称为工具酶。限制性核酸内切酶不仅是DNA重组中重要的工具，而且还可以用于基因组酶切图谱的鉴定。

寄主控制的限制与修饰现象：限制与修饰系统是细胞的一种防卫手段。各种细菌都能合成一种或几种能够切割DNA双链的核酸内切酶，它们以此来限制外源DNA存在于自身细胞内，但合成这种酶的细胞自身的DNA不受影响，因为这种细胞还合成了一种修饰酶，对自身的DNA进行了修饰，限制性酶对修饰过的DNA不能起作用。这种现象被称为寄主控制的限制与修饰现象。
限制性核酸内切酶的类型及特性，按限制酶的组成、与修饰酶活性关系以及切断核酸的情况不同，分为三类：
1. 第一类（I型）限制性内切酶：
能识别专一的核苷酸顺序，并在识别点附近的一些核苷酸上切割DNA分子中的双链，但是切割的核苷酸顺序没有专一性，是随机的。这类限制性内切酶在DNA重组技术或基因工程中用处不大，无法用于分析DNA结构或克隆基因。这类酶如EcoB、EcoK等。
2. 第二类（II型）限制性内切酶：
能识别专一的核苷酸顺序，并在该顺序内的固定位置上切割双链。这类限制性内切酶的识别和切割的核苷酸都是专一的，因此，这种限制性内切酶是DNA重组技术中最常用的工具酶之一。这种酶识别的专一核苷酸顺序最常见的是4个或6个核苷酸，少数也有识别5个核苷酸以及7个、8个、9个、10个和11个核苷酸的。 II 型限制性内切酶的识别顺序是一个回文对称顺序，即有一个中心对称轴，从这个轴朝二个方向“读”都完全相同。这种酶的切割可以有两种方式：
粘性末端：
交错切割，结果形成两条单链末端，这种末端的核苷酸顺序是互补的，可形成氢键，所以称为粘性末端

如EcoRI的识别顺序为：

5'…… G'AA|TT_C ……3'

3'…… C_TT|AA'G …… 5'

垂直线表示中心对称轴，从两侧“读”核苷酸顺序都是GAATTC或CTTAAG，这就是回文顺序（palindrome）。_和'表示在双链上交错切割的位置，切割后生成

5'G……… 5'.AATTC

3'CTTAA.和3'……...G二个DNA片段，各有一个单链末端，二条单链是互补的，其断裂的磷酸二酯键以及氢键可通过DNA连接酶的作用而“粘合”。　　　　　

平头末端：

II型酶切割方式的另一种是在同一位置上切割双链，产生平头末端。例如EcoRV 的识别位置是：

5'…… GAT'|ATC …… 3'

3'…… CTA'|TAG …… 5' 　

切割后形成5'…… GAT ATC …… 3'

3'……CTA和 TAG……5'二个片段，这种末端同样可以通过DNA连接酶连接起来。
3. 第三类（ III型）限制性内切酶：
也有专一的识别顺序，但不是对称的回文顺序，在识别顺序旁边几个核苷酸对的固定位置上切割双链。但这几个核苷酸对不是特异性的。因此，这种限制性内切酶切割后产生的一定长度DNA片段，具有各种单链末端。因此不能应用于基因克隆。

主要试剂

1. R-pGEX-4T-1质粒DNA

2. XhoⅠ酶（TaKaRa公司）

3. EcoRⅠ酶（TaKaRa公司）

4. 10×H Buffer（TaKaRa公司）
5. 无菌水

6. DNA marker 2000（TaKaRa公司）

7. 琼脂糖

8. 1×TAE

9. 10mg/mL溴化乙锭溶液（EB）（0.5μg/mL终浓度，20mL胶加1μL）

10. 10×Loading Buffer:1%SDS/50%Glycerol(甘油)/0.05%Bromophenol Blue(溴酚蓝)

主要设备

1. 琼脂糖凝胶电泳系统（电泳槽、电泳仪和制胶装置）