实验室分析仪器--液相色谱柱的柱性能评价标准
色谱柱的类型和构型(粒度、长度、内径等)选择通常由分离目的决定,对特定类型的色谱柱,不同的品牌之间也可能存在很大的差异。色柱要求的主要性能指标包括理も相浓度、色谱柱的稳定性等。
许多生产商为每支色谱柱提供测试色谱图和前四项数据,有的厂家也提供同一批次或不同批次保留值重现性的数据、键合相浓度数据与柱稳定性数据
1.理论塔板数
塔板数(M)是色谱柱的一个基本参数,一支色谱柱的理论塔板数越高,则流出曲线的方差或峰宽越小,色谱峰越尖锐,表明色谱柱对溶质的分离能力强,即柱效高
提高色谱柱理论板数的因素包括:色谱柱填充良好、增加色谱柱长度、在最佳流速下运行、采用较小粒度固定相、采用低黏度流动相、升高色谱柱温度、采用小分子化合物测定。
表3中给出了填充良好的各种长度与粒度不同固定相的典型HPLC色谱柱在最佳条件下的塔板数(采用小分子中性样品,分子量约为200)。
表3 在最佳测试条件下,填充良好的HPLC色谱柱的塔板数
微粒直径/μm | 柱长/cm | 塔板数N |
10 | 15 | 6000~7000 |
10 | 25 | 8000~10000 |
5 | 10 | 7000~9000 |
5 | 15 | 10000~12000 |
5 | 25 | 17000~20000 |
3 | 5 | 6000~7000 |
3 | 7.5 | 9000~11000 |
3 | 10 | 12000~14000 |
3 | 15 | 17000~20000 |
1.7 | 5 | 约10000 |
一般情况下,正常装填的色谱柱对小分子样品分离的理论塔板数可近似表示为:
式中,L为柱长,cm;dp为固定相粒径,μm。
2.峰不对称度
不对称的色谱峰可能导致塔板数与分离度测定不准确、定量不准确、分离度降低与检不出峰尾中的小峰、保留值的重现性不好等
实际工作中,通常采用峰不对称因子As表示峰形的不对称度或拖尾程度,理想色谱峰的As值为0.95~1.1(对称峰As=1.0),实际分析中被测样品的As值一般应小于1.5。
《美国药典》、《中国药典》等规定用色谱柱拖尾因子(T)表示色谱峰的对称性。表4中列出了两者的对应关系:
表4 峰不对称因子与峰拖尾因子的关系
峰不对称因子(10%峰高) | 1 | 1.3 | 1.6 | 1.9 | 2.2 | 2.5 |
峰拖尾因子(5%峰高) | 1 | 1.2 | 1.4 | 1.6 | 1.8 | 2 |
3.渗透性
色谱柱的滲透性可以用特定条件下的压力降作为衡量指标。滲透性与运行条件、色谱柱尺寸和固定相粒度有关。随色谱柱增长和固定相粒径减小反压升高,用不规则微粒固定相填充的色谱柱压力可能会较高。不同品牌的固定相粒度分布范围差别较大,因此反压也可能有很大的差异。供应商报告的反压一般是在特定操作条件下测试的结果。
球形固定相填充的色谱柱的压力降可近似表示为:
式中,P为压力降,psi(1psi-6894.76Pa);n为流动相黏度,cP
4.柱体积
不同规格的色谱柱所填充的固定相量很容易被估算,但是由于不同品牌、基质的固定相密度差别较大,估算的结果有时偏差较大。高效液相色谱柱的固定相填充体积与质量之间的近似关系在表5中给出。
表5 填充高效液相色谱柱体积计算表
OD×L/(mm×cm) | 色谱柱管总体积[π(OD/2)2L]/ml | 固定相体积/ml | 固定相质量/g |
1.0×100 | 0.086 | 0.06 | 0.07 |
1.0×150 | 0.114 | 0.08 | 0.10 |
2.1×100 | 0.343 | 0.24 | 0.29 |
2.1×150 | 0.529 | 0.37 | 0.45 |
4.6×100 | 1.657 | 1.16 | 2.11 |
4.6×150 | 2.500 | 1.75 | 2.11 |
4.6×250 | 4.143 | 2.90 | 3.50 |
7.8×300 | 14.343 | 10.04 | 12.12 |
10.0×150 | 11.786 | 8.25 | 9.96 |
10.0×250 | 19.643 | 13.75 | 16.59 |
10.0×300 | 23.557 | 16.49 | 19.90 |
21.0×250 | 86.586 | 60.61 | 73.15 |
50.0×250 | 490.871 | 343.61 | 414.69 |
色谱柱的死体积是指色谱柱中除固定相之外的体积,不同规格色谱柱的大约死体积如表6所示。对常规分析柱,内径4.6mm、柱长150mm和250mm的色谱柱死体积分别约为1.5ml和2.5ml,当流动相线速度为1ml/min时,死时间约为1.5min和2.5min。
表6 不同规格色谱柱的死体积
色谱柱种类 | 柱长/mm | 柱内径/mm | 大约死体积 |
纳米柱 | 150 150 | 0.075 0.10 | 400ml 700ml |
毛细血管柱 | 150 150 | 0.3 0.5 | 6μl 15μl |
微径柱 | 150 | 1.0 | 70μl |
细内径柱 | 15 30 50 | 2.1 2.1 2.1 | 30μl 60μl 100μl |
溶剂节省柱 | 100 150 | 3.0 3.0 | 0.43ml 0.64ml |
分析柱 | 15 30 50 75 150 250 | 4.6 4.6 4.6 4.6 4.6 4.6 | 0.15ml 0.30ml 0.50ml 0.75ml 1.5ml 2.5ml |
