实验室分析仪器--液相色谱柱的结构与特征
一、色谱柱的分类
基于不同原理和角度,高效液相色谱柱和固定相可以有不同的分类方式。液固色谱固定相按基质材料可分为无机氧化物、聚合物等主要类型;按结构和形状分为薄壳型和全孔型,无定形和球形,整体柱等;按固定相表面改性与否分为吸附型和化学键合型;按照分离模式可以分为正相、反相、离子交换、疏水作用、体积排阻、亲和、手性等类型;按照分离规模及色谱柱的几何尺寸,可以分为制备柱、分析柱、微型柱等类型。表1中已经给出了按照分离模式分类的原理及适用范围;表2中列出了柱型与样品容量的关系。
表1 液相色谱法分类
按固定相形态分类 | 按作用原理分类 | 按物理特征分类 | |||
固定相 | 名称 | 原理 | 名称 | 特征 | 名称 |
液体 | 液-液色谱 | 分配 | 液-液分配色谱 | 平面固定相 | 平面色谱 |
固体 | 液-固色谱 | 吸附 | 液-固吸附色谱 | 纸固定相 | 纸色谱 |
分子大小 | 体积排阻色谱 | 薄层固定相 | 薄层色谱 | ||
离子交换能力 | 离子交换色谱 | 颗粒固定相填充 | 填充色谱 | ||
亲和力 | 亲和色谱 | 色谱柱中空 | 空心柱色谱 | ||
电渗及电泳 | 毛细管电泳 | 采用高压流动相 | 高压液相色谱 |
表2 液相色谱的不同柱型
柱 型 | 柱内径 | 流动相流速 | 样品容量 |
制备注 | 4in(≈100mm) | 960ml/min | 2.5g |
制备柱 | 2in(≈50mm) | 240ml/min | 600mg |
制备柱 | 1in(≈25mm) | 61ml/min | 150mg |
半制备柱 | 9mm | 11ml/min | 25mg |
常规柱 | 4.6mm | 0.5~2.0ml/min | 0.2~7mg |
细内径柱 | 2.1mm | 0.2~0.4ml/min | 0.05~0.2mg |
微柱 | 0.8~1.0mm | 25~60μl/min | 50~500mg |
毛细管柱 | 0.1~0.5mm | 1~15μl/min | 1~50μg |
纳米柱 | ≤ 0.1mm | ≤ 1μl/min | ≤ 1μg |
二、色谱柱的结构
现代高效液相色谱大多采用小粒径固定相以获得高柱效,较大的阻力需要在高压下运行,这也要求色谱柱及其连接必须满足耐高压、不泄漏、死体积小等条件。为了保证色谱だ具有良好的密封性能,通常使用带锥套的线密封连接方式。图1给出了常见的高效液相色谱柱结构。
图1 色谱柱结构
1—塑料保护堵头;2—柱头螺栓;3—刃环;4—密封圈;5—筛板;6—色谱柱管;7—固定相
在图1中,当旋紧柱头螺母时,刃环在压力作用下向左方移动,刃环前端很海的边沿在挤压下会变形并包紧色谱柱管,同时与锥面接触形成环状的密封面。这种由金属在高压下变形而形成的密封紧密可靠,可保证色谱柱在非常高的压力下正常工作。
不同厂家生产的色谱柱出口和入口的接头长度和刃环的角度不同,因此,不同品牌的色谱柱可能需要使用不同的金属刃环和接头,可采用通用接头或者PEEK接头。
三、柱性能评价
色谱柱的类型和构型(粒度、长度、内径等)选择通常由分离目的决定,对特定类型的色谱柱,不同的品牌之间也可能存在很大的差异。色柱要求的主要性能指标包括理も相浓度、色谱柱的稳定性等。
许多生产商为每支色谱柱提供测试色谱图和前四项数据,有的厂家也提供同一批次或不同批次保留值重现性的数据、键合相浓度数据与柱稳定性数据
1.理论塔板数
塔板数(M)是色谱柱的一个基本参数,一支色谱柱的理论塔板数越高,则流出曲线的方差或峰宽越小,色谱峰越尖锐,表明色谱柱对溶质的分离能力强,即柱效高
提高色谱柱理论板数的因素包括:色谱柱填充良好、增加色谱柱长度、在最佳流速下运行、采用较小粒度固定相、采用低黏度流动相、升高色谱柱温度、采用小分子化合物测定。
表3中给出了填充良好的各种长度与粒度不同固定相的典型HPLC色谱柱在最佳条件下的塔板数(采用小分子中性样品,分子量约为200)。
表3 在最佳测试条件下,填充良好的HPLC色谱柱的塔板数
微粒直径/μm | 柱长/cm | 塔板数N |
10 | 15 | 6000~7000 |
10 | 25 | 8000~10000 |
5 | 10 | 7000~9000 |
5 | 15 | 10000~12000 |
5 | 25 | 17000~20000 |
3 | 5 | 6000~7000 |
3 | 7.5 | 9000~11000 |
3 | 10 | 12000~14000 |
3 | 15 | 17000~20000 |
1.7 | 5 | 约10000 |
一般情况下,正常装填的色谱柱对小分子样品分离的理论塔板数可近似表示为:
式中,L为柱长,cm;dp为固定相粒径,μm。
2.峰不对称度
不对称的色谱峰可能导致塔板数与分离度测定不准确、定量不准确、分离度降低与检不出峰尾中的小峰、保留值的重现性不好等
实际工作中,通常采用峰不对称因子As表示峰形的不对称度或拖尾程度,理想色谱峰的As值为0.95~1.1(对称峰As=1.0),实际分析中被测样品的As值一般应小于1.5。
《美国药典》、《中国药典》等规定用色谱柱拖尾因子(T)表示色谱峰的对称性。表4中列出了两者的对应关系:
表4 峰不对称因子与峰拖尾因子的关系
峰不对称因子(10%峰高) | 1 | 1.3 | 1.6 | 1.9 | 2.2 | 2.5 |
峰拖尾因子(5%峰高) | 1 | 1.2 | 1.4 | 1.6 | 1.8 | 2 |
3.渗透性
色谱柱的滲透性可以用特定条件下的压力降作为衡量指标。滲透性与运行条件、色谱柱尺寸和固定相粒度有关。随色谱柱增长和固定相粒径减小反压升高,用不规则微粒固定相填充的色谱柱压力可能会较高。不同品牌的固定相粒度分布范围差别较大,因此反压也可能有很大的差异。供应商报告的反压一般是在特定操作条件下测试的结果。
球形固定相填充的色谱柱的压力降可近似表示为:
式中,P为压力降,psi(1psi-6894.76Pa);n为流动相黏度,cP
4.柱体积
不同规格的色谱柱所填充的固定相量很容易被估算,但是由于不同品牌、基质的固定相密度差别较大,估算的结果有时偏差较大。高效液相色谱柱的固定相填充体积与质量之间的近似关系在表5中给出。
表5 填充高效液相色谱柱体积计算表
OD×L/(mm×cm) | 色谱柱管总体积[π(OD/2)2L]/ml | 固定相体积/ml | 固定相质量/g |
1.0×100 | 0.086 | 0.06 | 0.07 |
1.0×150 | 0.114 | 0.08 | 0.10 |
2.1×100 | 0.343 | 0.24 | 0.29 |
2.1×150 | 0.529 | 0.37 | 0.45 |
4.6×100 | 1.657 | 1.16 | 2.11 |
4.6×150 | 2.500 | 1.75 | 2.11 |
4.6×250 | 4.143 | 2.90 | 3.50 |
7.8×300 | 14.343 | 10.04 | 12.12 |
10.0×150 | 11.786 | 8.25 | 9.96 |
10.0×250 | 19.643 | 13.75 | 16.59 |
10.0×300 | 23.557 | 16.49 | 19.90 |
21.0×250 | 86.586 | 60.61 | 73.15 |
50.0×250 | 490.871 | 343.61 | 414.69 |
色谱柱的死体积是指色谱柱中除固定相之外的体积,不同规格色谱柱的大约死体积如表6所示。对常规分析柱,内径4.6mm、柱长150mm和250mm的色谱柱死体积分别约为1.5ml和2.5ml,当流动相线速度为1ml/min时,死时间约为1.5min和2.5min。
表6 不同规格色谱柱的死体积
色谱柱种类 | 柱长/mm | 柱内径/mm | 大约死体积 |
纳米柱 | 150 150 | 0.075 0.10 | 400ml 700ml |
毛细血管柱 | 150 150 | 0.3 0.5 | 6μl 15μl |
微径柱 | 150 | 1.0 | 70μl |
细内径柱 | 15 30 50 | 2.1 2.1 2.1 | 30μl 60μl 100μl |
溶剂节省柱 | 100 150 | 3.0 3.0 | 0.43ml 0.64ml |
分析柱 | 15 30 50 75 150 250 | 4.6 4.6 4.6 4.6 4.6 4.6 | 0.15ml 0.30ml 0.50ml 0.75ml 1.5ml 2.5ml |
