分析测试百科网 > 行业资讯 > 会议会展

质谱沙龙第十七期活动报道

2009.4.01

色谱质谱界著名专家为您揭示：我们还需做出什么努力，来迎接痕量分析的挑战？AB总部Qtrap产品线经理现场介绍5500新看点……

2009年3月28日下午，质谱沙龙第十七期活动在第二炮兵总医院制剂楼举行。此次到会者除了来自发酵研究院、二炮总医院、解放军307医院、军事医学科学院、中科院生化工程国家重点实验室、AB公司等老朋友外，还有来自北京出入境检验检疫局、天津博纳艾杰尔科技、媒体的新朋友。报告后的讨论一直洋溢着热烈的气氛。

第十七期质谱沙龙活动现场

痕量检测与有机质谱分析：系统揭示痕量分析的原理、发展和技术

首先由在色谱质谱、法医鉴定领域享有盛誉的专家汪聪慧教授为大家介绍题为《痕量检测与有机质谱分析》的报告。

汪聪慧教授

灵敏度为何重要？

汪教授回顾了有机质谱灵敏度的发展，从50年代的mg数量级，发展到现代21世纪的pg、甚至亚pg（几十～几百fg）数量级。为什么不断追求灵敏度？汪教授举了几个典型的例子指出痕量分析面临的挑战。

比如农兽药残留中，蜂蜜中的氯霉素分析，要求到达ppb级的数量级。
毒品检测方面，遇到的难题是，有些毒品（如海洛因）在人体内代谢速度相当快，在现场虽然可以对血液或是尿液进行检测，但是几天后即无法检测。这样出现了另一种技术来检测头发或指甲，这种技术可保存毒品的原体，即不会快速代谢掉。除保存原体的优势外，该方法还可了解使用毒品的时间，因为头发是在不断生长的。虽然目前国内外都用头发检测毒品，但需取样10根头发，灵敏度还不能达到只取样1根头发。加入仪器灵敏度更高，可检测1根头发的话，就可以把头发切成不同的段分别测定，不仅可测定毒品含量，还可测定使用的时间。
食品中污染物检测的难点，典型的是对牛奶中二恶英的检测，人体内每天最多允许2pg，这就对灵敏度提出很高的要求。
在兴奋剂检测方面，对甾体类化合物的检测存在一定的难度，甾体类化合物分为外源性和内源性两种，前种属于人体内不含有的物质相对来说比较容易检出，而后者在人体内本身可以合成，给检测带来难度，至少要求检测浓度≤2ppb，并要求拿到全谱。

可靠性更重要！

汪教授指出当今有机质谱痕量检测迎接的挑战主要指两方面，一是要在复杂体系中实现灵敏、快速、可靠、准确的分析；二是最重要的检测基础就是可靠准确，离开可靠性去谈灵敏快速是无意义的。

以前，做复杂体系的检测，多是前端用GC或LC分离，后面用质谱的多离子检测，而多离子检测的干扰很大。对于痕量确认来说，从复杂体系分析的可靠性来说，在法医科学中，不仅要求检出几个离子（如SIM离子），还要求质谱必须拿到全谱，并且要求谱图匹配率达到80%以上。而对于GC/MS/MS或LC/MS/MS，可靠性都已经大大提高；但与此同时，为了提高可靠性，除了MRM定量外，还需要做一个MS/MS全扫描谱。

下面举例了一个对比表，来说明方法的可靠性问题：

用GC/MS SIM，如选择3个SIM离子，可靠性是10⁶，即有百万分之一的可能出错；而选择2个SIM离子，可靠性是10⁴，即有万分之一的可能出错。

再比如法医鉴定用的指纹分析，出错率是（10⁹～10¹⁰）十亿～一百亿分之一，故指纹鉴定技术相当可靠。而DNA分析的可靠性为10⁶～10⁷，所以没有指纹的可靠性高。

现在在农兽药残留检测中，欧盟提出了IP > 4点法，即超过4点，才能证实方法的可靠性。保留时间基本一致，要求2对以上特征离子MRM，还要考虑被选择离子的比率要一致（被分析物和标准品相比），比如偏差正负10％。

下载参考：欧盟方法EU Guideline 2002/657/EG

汪教授还给出了几个例子来进一步解释可靠性的重要性和作用。

化学计量学：从复杂成分中提取更多的信息

接下来介绍了化学计量学在痕量分析中的作用。化学计量学应用数学、统计学和其他方法和手段（包括计算机）选择最优试验设计和测量方法，并通过对测量数据的处理和解析，最大限度地获取有关物质系统的成分、结构及其他相关信息。

GC-MS和LC-MS联用，也是化学计量学的应用领域。狭义的理解仅仅是：模拟信号的平滑、扣除本底、数字化处理、出一些表格和谱图。其实，数据处理的功能不局限于此，它还能解析复杂体系内的重叠峰。广义的数据处理也就包括了以下三个部分：峰形分析处理、模式识别、人工智能。

峰形处理一般采用去卷积法（deconvolution），一般使用两种技术：反褶技术和交替回归法。可解决的问题有：由于本底的干扰导致分辨率下降，引起的峰重叠/叠加，峰变形、峰位移。这些在痕量分析、复杂物分析中都常常遇到。

灵敏度的问题

现在仪器的灵敏度相当高，但在实际应用中好像还觉得灵敏度不够，主要是由三个问题引起：（１）前处理；（２）质谱；（３）色谱柱。

第（1）个问题——前处理问题非常重要，很多决定着试验的成败。

前处理的手段包括：
a) 溶剂萃取
b) 快速溶剂萃取：即用加压、加温的方式来提取，主要效果是快速、耗费溶剂少
c) 固相萃取
d) 凝胶渗透萃取：GPC Cleanup
e) 免疫亲和试剂法

在固相萃取方面，汪教授特别介绍了新型的QuEchERS方法，其主要特点是回收率高、重现性高。

从前处理的选择性上看，免疫亲和方法 > SPE > GPC，GPC是在大类上去除大分子，得到待分析的小分子。而免疫亲和是极其特异性地去除所有杂质干扰，直接获得待分析的小分子，处理过程相当简单，它是净化效果最好的一种，但是代价昂贵。SPE介于二者之间，但并不能完全除去杂质。从某种程度上来说，当前处理净化后只剩余小分子时，GC、LC应该都能达到较好的效果。

（2）质谱的问题，主要指应把质谱仪器调整到正常状态（不是最高状态，而是正常状态），要对仪器要时常核查，保证其处于正常状态。质谱本身来说，离子源、真空系统对灵敏度的贡献最大。

（3）色谱柱的问题：汪教授也举例了色谱柱对灵敏度、分离度的影响，并阐述了重要性。

快速和高通量

要想实现快速的痕量分析，脱离不开自动化，目前已出现了很多仪器，比如自动顶空、热脱附、固相萃取和固相微萃取、GPC＋自动浓缩。高度的自动化，将使分析速度加快。

样品的污染问题

样品的污染是指前一针做完，洗针后，还是有前一针的样品残留。对于HPLC，有一项指标是自动进样器的交叉残留。从现有厂家公布的结果来看，岛津和资生堂的自动进样器交叉残留最小。交叉残留常见的指标是：0.1%，0.05%（无底座，Loop进样）、0.005%（只有少数几家，如岛津、资生堂）。洗针的方式也比较重要，比如超声清洗就比浸泡清洗效果好。在残留检测中，为减少残留，很多要不断洗针，就会耽误时间。无缝的针也是一种解决的办法。

定量准确性

主要介绍质谱的Cross talk（交叉污染）效应。Cross talk的定义是：MRM分析时，母离子不同，子离子相同，前面还没有离开碰撞室，后面的就开始碰撞。这时前一个MRM通道就会对后一个MRM有干扰，定量就不准确。要进行几百对离子的分子的分析，必须降低Cross Talk。

几家公司都从一定的技术上来减小Cross talk效应，比如LINAC技术（AB公司）、T-Wave技术（Waters公司）、Instantaneously Dump瞬间去除（Thermo和Varian公司）技术。

精彩的报告结束了，大家还无限回味，踊跃提问。比如问道QuEchERS方法是过滤或离心的问题。从实际效果上看，由于填料的密度较小，所以用离心可能会漂浮，所以用过滤的方法会更好。目前，国标还是用传统方法，因此对人的操作要求较高；而QuEchERS方法最突出的特点是对人的操作要求不高，回收率重现性很高。

报告下载：痕量检测与有机质谱分析

本网收录前沿Lab：中国农科院农业环境与可持续发展研究所分析测试中心

相关链接：

农药多残留分析中QuEchERS方法介绍

QuEChERS-GC/MS 农药多残留同时快速分析方法的研究和应用

QuEchERS方法专用于分散SPE产品的农药残留分析

果蔬中54种农药残留的QuEChERS/GC-MS快速分析

美国AOAC上发表的多残留检测QuEChERS的方法

Qtrap 5500在定量方面的应用

AB公司的Mauro Aiello博士向大家介绍了Qtrap5500系列质谱仪及其在定量分析中的应用，AB公司的李丹博士为大家进行了详细的同步翻译。Mauro Aiello博士是API 5000的主要设计人之一，现在是Qtrap产品线经理。

AB公司Qtrap产品线经理 Mauro Aiello博士

AB公司李丹博士

AB从去年秋天推出了5500和5500 Qtrap仪器。这一代仪器相比前一代或前几代仪器，体积非常小；有和前代同样的TruboV源，和新的离子光学：

（1）弯曲的碰撞室减少了44％的体积；减轻分子泵的压力（只需一个分子泵）
（2）相比API 5000，Q-Jet加长，是原来的2.5倍（API 5000为5cm，5500为12.5 cm）
（3） Q3也是线性加速的，使离子可以快速到达检测器。同时，加速的线性离子阱，在达到2000 amu/sec速度时，可达到很精确的分子量。

相对于API 5000的改进

5500系列在灵敏度上做出了一些改进，（1）3.5倍大气真空压力；（2）离子引导Qjet相对于5000是加强的；（3）ZL设计的弯曲碰撞室；（4）减少分析器的压力从而降低对发射离子的影响；（5）在固定电荷领域里面加大射频电压。

Qtrap5500系列沿用了Turbo V™离子源系统，该系统的优点：喷针和锥孔呈90度夹角；兼顾ACPI源；易于拆卸清洗；能达到大流量。（顺便，李丹博士提到，昨天拜访客户，谈到AB在大流速测定时的优势，客户问道：走大流速会提高灵敏度，但有人会抱怨噪音会增加怎么办？Mauro Aiello博士告诉了客户TurboV的使用诀窍：可降低喷针电压，如从5500 V降低到1500 V，会显著降低噪音，S/N有意想不到的提高。）

Qtrap5500采用了12.5cm的Qjet离子传输装置，比5000（5 cm）在长度上大出2.5倍；Qjet离子传输装置属于AB公司的ZL技术，跟其它的六极杆、八极杆不同，该技术仅仅是利用射频电压使电子快速导入Qo中，同时可以使离子更好聚焦，对真空有优势，并提高灵敏度。

Mauro Aiello博士还举例显示了：

（1）快速采集数据，灵敏度不损失：Qtrap5500当dwell time（离子驻留时间）从1,000 毫秒降低到1毫秒时，灵敏度并没有降低。

（2）快速采集数据，不损失数据质量：Qtrap 5500的创新设计使其即使在2毫秒的驻留时间（dwell time）、2～3毫秒的MRM切换速度下，不降低数据质量，因此真正解决了当前MRM速度的瓶颈。同时，正负离子扫描切换时间能够达到50ms。

接下来介绍了Qtrap5500和超快速液相色谱（岛津UFLC）联用时的性能表现，实验基本参数为：1.25mL/min的大流速，柱温控制在45°，Agilent < 2um柱子，没有分流，1 min的梯度。对75种杀虫剂、150对MRM离子对进行快速定量分析，通过实验得出，如果缩短每一个MRM离子对的检测时间（cycle time），就会得到十分准确的峰图；因为如果用传统方法长时间检测，在快速液相这种方法中会丢失很多峰。该技术使检测时间（cycle time）从10ms缩短到5ms，时间降低了50%，从而CV值由9.1%降低到5.5%。同时，缩短MRM检测时间，并没有出现交叉污染（cross talk）问题。最低检测限CV 3%，定量线性范围是105。

稳定性测试：对Qtrap 5500进行稳定性实验，在连续3天内进行1300针的血浆进样，CV值变化在3.3%，证明仪器了稳定性。

相对于Qtrap4000的改进

相同点是：都采用了Turbo V™离子源和线性离子阱；不同点是：Qtrap5500采用更为耐用的检测器，体积由于采用了弯曲设计相对缩小了44%，三重四极杆灵敏度提高了5～10倍，线性离子阱灵敏度普遍提高50倍以上（根据被测化合物性质的不同提高10～100倍），并实现了更快的正负离子切换（提高了10倍）。

通过对Q3上也应用线性加速的功能，使得快速导入更多的离子到检测器，同时对空间电路革新（fringe filed技术）来实现线性离子阱灵敏度的提高。在冷却过程中加入脉冲气体，减少了离子阱碎裂时间，从而提高了扫描速度可到20,000Da/Sec。在Qtrap5500可以很清楚地看到碎片峰的出现。

由于Qtrap 5500灵敏度很高，在复杂基质的代谢物鉴定中，使用Qtrap5500可以对样品进行稀释从而降低生物基质的影响。举例了一个实验，Qtrap5500（5 min液相，20,000 amu/sec），4000 Qtrap（30min液相，4,000 amu/sec）作代谢物鉴定的实验，同样获得很好的结果。在二级碎片峰的灵敏度和未知物鉴定上，Qtrap 5500相对于Qtrap 4000拥有更为丰富的谱图，更有利于进行库检索来鉴定未知物。

创新的MS3定量方法（MS3Quant）

Qtrap5500采用了创新的MS3定量方法，具体就是在Q1选择母离子，在Q2弯曲碰撞室里打碎选择子离子，子离子再到线性离子阱里面进行离子阱的碎裂，找到特征的三级碎片峰。由于扫描速度很快，所以Qtrap5500可以实现MS3定量的方法。

MS3Quant的主要优势是针对基质复杂的样品大幅提高S/N。举例显示了在没有生物基质时，S/N并没提高，而在生物基质中，MRM 的S/N＝10，MRM3的S/N提高到147，获得了本质性的飞跃。另一个例子显示了相对于传统MRM，MS3 定量可以明显分离出非目标化合物，信噪比得到提高，减少了生物基质对目标样品的干扰。

Qtrap5500其它技术上的优势

Qtrap5500其它的优点在于可以和其它的离子源兼容，全新的1.5版本工作站，气体要求和API 5000相当，由于体积缩小所以采用单个的机械泵和分子涡轮泵，对泵的要求减少。

新的设计使Qtrap5500系列拥有一个工作试验台，可以把氮气发生器放进里面，由于整体体积的缩小，可以在仪器上面放置流动相和色谱系统实现一体化操作。

最后总结了Qtrap5500系列质谱仪的优势：与Qtrap 4000相比，MRM和离子阱扫描灵敏度都得到了很大程度的提高；创新的MS3定量方法通过三级碎片峰对样品进行定量分析，减少了生物基质的干扰；可以同时实现定性定量分析；整个检测限有了一个提高，减少样品前处理过程或者是减少实际样品的消耗量。

本网站收录的相关产品：QTRAP5500 四极杆-线性阱杂交质谱仪

HPLC-MS-MS法研究盐酸奥洛他定片人体药代动力学

来自解放军307医院临床药理室郝光涛老师，为大家介绍了题为：《HPLC-MS-MS法研究盐酸奥洛他定片人体药代动力学》的报告。

解放军307医院临床药理室郝光涛老师

解放军307医院是军事医学科学院附属医院，是国家药物临床实验机构，主要的研究工作是人体药代动力学和一期临床试验，质谱方面主要应用串联四极杆进行定量工作，接下来郝光涛老师为大家介绍了HPLC-MS-MS法研究盐酸奥洛他定片人体药代动力学的研究项目。

盐酸奥洛他定（Olopatadine Hydrochloride）首先是由日本开发的新型抗过敏药物，2000年在美国首次获得上市许可。用于抗过敏性鼻炎，抗荨麻疹，改善皮肤病伴瘙痒症状的治疗。该药物主要研究方向是在中国健康人体内的药代动力学特性，为临床安全、合理用药提供参考依据。

本试验选择健康成年志愿者12名，男性6名，女性6名。采用随机单次口服给药，使用HPLC-MS-MS方法（1200-API 3000）检测人体血样和尿样中的药物浓度，研究该药物在人体内吸收、分布、代谢及排泄的规律。MRM离子对：奥洛他定（338—247），内标地西泮（285—193）。

在上述工作完成的基础上，郝老师系统地介绍了国家药代动力学的指导原则所要求的考察项目，并根据该原则设计的实验及获得的结果。

 特异性(Specificity)：LC/MS/MS法比较特异（略）
 基质效应（Matrix）
 标准曲线和定量范围（Calibration Curve）
 定量下限（Lower Limit of quantitation，LLOQ）
 精密度与准确度（Precision and Accuracy）
 样品稳定性(Stability)
 提取回收率（Recovery）
 方法学质控（QC）

基质效应

郝老师重点介绍了基质效应。在采用质谱方法研究时基质效应对定量分析的影响非常大。FDA和我国SFDA注册审评时要求对基质效应进行考察，但用什么方法考察还没有明确的规定。通用的方法是考察绝对基质效应或相对基质效应。

绝对基质效应：通过调节色谱柱或液相的各种条件，目的是使被测药物和基质能够分离开不存在干扰；相对基质效应：在检测生物样本时，虽然基质对定量有干扰，但把干扰控制在一定范围内，使其对检测结果影响控制在±20%之间。

该研究采用最低定量限来考察相对基质效应，具体方法是选择6名不同受试者，服药后空白血液或尿液，通过对最低定量限的考察，如果最低定量限的偏差在±20%之间，那么就可以说明该方法的基质效应是过关的，不影响数据测定的结果。该方法适用于大批量生物样本的检测，节省时间和成本。在此基础上，美国大药厂有时要求用低、中、高三种浓度来考察相对基质效应。

绝对基质效应一种是用标准品直接进样，另一种是用三通接入，一边注射样品，再注射进基质，看药物基线是上升还是下降。这种方法一是麻烦，二是不能体现出数据。而上文也谈到，6名不同受试者，最低定量限偏差±20%是可以体现数据的。

相关链接：

标准曲线和定量范围

要求定量范围能覆盖全部待测生物样品的浓度范围，对于个别浓度高的样品进行稀释后也可再进行测定。

定量下限

定量下限要求满足测定3～5个消除半衰期时样品中的药物浓度，或能检测出Cmax的1/10～1/20的药物浓度。

精密度与准确度

精密度考察就是一天对一批样品的低、中、高三个浓度分别进行检测，郝老师对此也提出了自己的一点疑问：如果一批样品中一个样品检测结果不正确，单独对该样品进行重复检测，直至达到批量的要求，而不再对整批样品检测，该方法是否可行？在座的几位专家倒是觉得可行，因为偶然的失败是可能的，但只要数据可溯源，实验有完备的记录就可以。准确度也是对一批样品的低、中、高三个浓度进行检测，利用±15%的相对回收率进行考察。

样品稳定性

样品稳定性主要进行四个方面的考察，首先进行生物样品在室温条件下4h的稳定性；第二是样品处理后在进样器中的稳定性，考察时间一般为4～6个小时，保证一批样品完全进样来确保数据的真实性；第三是考察生物样本反复冻融三次的稳定性；最后考察的就是生物样品长期放置的稳定性，时间一般为1个月。

提取回收率

提取回收率主要是进行液液萃取和固相萃取的方法进行考察。

方法学质控

以上考察方面合格以后，最后进行未知样品的生物测定。需要提供低、中、高三个浓度的质控样品，根据指导原则数量不能小于每批样品的6%，最多允许有2个不合格样品，但是这两个样品浓度不能一样。

最后郝老师给大家展示了该方法药代动力学参数、血药浓度时间曲线和尿药累积排泄曲线的检测成果。

报告下载：HPLC-MS-MS法研究盐酸奥洛他定片人体药代动力学

本网站收录的相关产品：

API 3000三重四极杆液质联用仪

Agilent 1200液相色谱系统

MAS：一种解决生物样品中强水溶性化合物提取的新型通用方法

最后由来自天津博纳艾杰尔科技有限公司的胡雪艳工程师为大家介绍了《MAS：一种解决生物样品中强水溶性化合物提取的新型通用方法》的报告。

天津博纳艾杰尔科技有限公司胡雪艳工程师

MAS方法开发的目的

胡工首先指出MAS是一种样品前处理方法，是主要针对生物样品中强水溶性化合物的一种新型前处理方法。

MAS的定义及流程示意图

在讲解MAS方法之前，胡工首先提到了基质固相分散萃取和QuEChERS这两个概念。前方法的特点就是将样品的基质和吸附剂填料混合在一起，然后通过溶剂洗脱得到目标化合物；后一种方法主要特点之一是介质分散固相萃取，另一主要特点为利用硫酸镁直接除水。

MAS方法是在上述两种方法的基础上，对固相萃取的进一步发展和完善。MAS方法即“多重机制杂质吸附萃取净化法”，主要通过多官能化的复合吸附材料，将生物样品中的主要干扰基质吸附，强水溶性的被测物质留在样品溶液中而达到净化和富集的目的。

MAS流程示意图

操作流程首先将样品基质和提取溶剂同时放入离心管中，然后进行震荡或超声提取，通过溶剂可以将样品中的目标物提取到溶剂中；然后加入SPE填料吸附净化样品基质干扰，离心后检测目标物被留在了溶液里；最后取上清液进行后处理或直接检测。

MAS方法的特点、优点及应用

一般的SPE方法需要活化柱子、上样、淋洗和洗脱这四个步骤，而MAS方法只需吸附样品杂质，达到提取和净化一步完成；另一特点就是使用多官能团吸附材料，同时除去多种杂质。优点是简单、高效、成本低、对操作人员的要求低。

MAS产品适用于瓜果蔬菜等样品基质、叶绿素较多的样品基质、含脂肪较多的样品基质、生物样品等小样量样品、去除酸性杂质以及肉、蛋、奶制品中三聚氰胺的样品前处理工作。

为阐述MAS方法的效果，胡雪艳工程师比较了在测定血清样品中药物及药物代谢物中，四种前处理方法的效果。见图1～图4，同Waters Oasis HLB小柱处理结果（图4）相比，直接蛋白沉淀法（图3）去除了大分子，但小分子杂质存在干扰。而图1和图2的MAS方法，都取得了很好的效果。那么，图1所用的MAS离心管式蛋白沉淀法优点就是：步骤简单、便宜、去除效果好；图2所用的MAS SPE方法优点就是：便宜、去除效果好。但在座的某些专家提出了两点疑问，也希望Agela公司通过更好的实验来证实。（1）所选用的色谱柱是ASB C18，并不是一根可以分离大蛋白的柱子，所以，虽然图1～图4都“显示”了净化掉了大的蛋白，但柱子本身也许根本就不会在10分钟以内得到蛋白的峰。（2）该实验实际假设了Waters Oasis HLB小柱的处理效果很好，但是并没有后面诸如质谱的直接证据来证实，的确去除了干扰的杂质，而不是去除了样品。