植物Rubisco测定试剂盒使用说明
● 产品组成：Plant Rubisco Assay Kit
| 组分货号 | 名称 | 规格 | 贮存 | 运输 |
| PU1060-01 | 试剂1-Rubisco提取缓冲液（2×） | 100 ml | 4℃ | 常温 |
| PU1060-02 | 试剂2-10×Assay buffer | 15 ml | -20℃ | 常温 |
| PU1060-03 | 试剂3-GAPDH（200×） | 1 KU | -20℃ | 常温 |
| PU1060-04 | 试剂4-PGK（100×） | 500 U | 4℃ | 常温 |
| PU1060-05 | 试剂5-CPK（100×） | 1 KU×2 | -20℃ | 常温 |
| PU1060-06 | 试剂6-ATP（100×） | 1.2 ml | -20℃ | 常温 |
| PU1060-07 | 试剂7-CrP（100×） | 1.2 ml | -20℃ | 常温 |
| PU1060-08 | 试剂8-NADH（100×） | 1.2 ml | -20℃ | 常温 |
| PU1060-09 | 试剂9-RuBP | 1.4 ml×2 | -20℃ | 常温 |
| PU1060-10 | 试剂10-酶溶解缓冲液 | 5 ml | -20℃ | 常温 |
| DE005 | 试剂11-灭菌水 | 100 ml | 4℃ | 常温 |
| BSA-02 | 试剂12-BSA溶液 50mg/ml | 5 ml | -20℃ | 常温 |
| DT0140P | 试剂13-1MDTT（100×） | 1 ml×2 | -20℃ | 常温 |
| PC2030-01 | 蛋白酶抑制剂 植物样品提取用(100×) | 1 ml | -20 | 常温 |
● 产品简介：
核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶(Rubisco)是光合作用碳代谢中的重要的调节酶，是植物中最丰富的蛋白质，主要存在于叶绿体的可溶部分，总量约占叶绿体可溶蛋白50％～60％。
这里1分子CO2被固定，就有2分子 NADH 被氧化。因此，由NADH氧化的量就可计算Rubisco的活性，由340nm吸光度的变化可计算NADH氧化的量。
为了使NADH的氧化与CO2的固定同步，需要加入磷酸肌酸(CrP)和磷酸肌酸激酶(CPK)的ATP再生系统。
按照一次使用0.5 ml 试剂1-Rubisco提取缓冲液（2×）计算，试剂盒可以测定200个样品。
● 自备材料：
植物材料；剪刀；液氮；研钵或其他研磨设备；1.5ml离心管；1ml石英比色皿；紫外分光光度计；制冰机；低温离心机
● 操作步骤：
一、 即用型Rubisco提取缓冲液配制：
| 一个反应配制体积 | n个反应配制体积 | |
| 1 ml | n×1 ml | |
| Rubisco提取缓冲液（2×） | 0.5 ml | n×0.5 ml |
| 灭菌水 | 470 μl | n×470 μl |
| 1 M DTT（100×） | 10 μl | n×10 μl |
| BSA溶液50mg/ml | 20 μl | n×20μl |
| 蛋白酶抑制剂（100×） | 10 μl | n×10μl |
注：1. 即用型Rubisco提取缓冲液尽量现配现用，短期4℃中可以过夜保存。
2. 为增强Rubisco的稳定性，提取缓冲液中可以加入蛋白酶抑制剂（Cat：PC2030）
二、 Rubisco样品提取：
1. 取新鲜植物组织，清洗干净，擦干，液氮中研磨，1 cm2叶片（1分硬币大小）或0.1g粉末加入1 ml 即用型Rubisco提取缓冲液，颠倒混匀，冰浴放置5-10分钟。
2.12000g4℃离心 10分钟，上清即为Rubisco样品提取液，常温放置备用（不要冰浴或4℃放置，常温放置可以保持Rubisco活性）。
注：Rubisco样品提取液最好立即测定，不建议保存。
三、 Rubisco活性测定分析：
1. 即用型酶溶解缓冲液配制：
按照标签所示，在试剂10-酶溶解缓冲液原瓶中加入1.5 ml灭菌水和1 ml BSA溶液（50mg/ml），混匀后即配成即用型酶溶解缓冲液，冰浴备用，-20℃保存。
2. 试剂3-GAPDH和试剂5-CPK按照标签所示加入即用型酶溶解缓冲液，混匀溶解后冰浴备用，-20℃保存。
3. 试剂4-PGK为硫酸铵悬浮液，4℃12000g离心5分钟，去除上清（小心去除，可以保留少许上清，不要吸弃沉淀），沉淀中按照标签所示加入即用型酶溶解缓冲液，混匀溶解后冰浴备用，-20℃保存。
4. 试剂9-RuBP：按照标签所示加入灭菌水，彻底混匀后冰浴备用。
注：RuBP溶液稳定性较差，用后-20℃保存，有效期3-4天，长期-80℃保存。
5. 试剂8-NADH：按照标签所示加入灭菌水，彻底混匀后冰浴备用。
注：NADH稳定性较差，用后-20℃贮存3-4天，长期-80℃保存。
6. 反应体系MasterMix配制：
| 加入顺序 | 组份 | 1ml反应体系加入量 | MasterMix配制 （测定n个样品为例） |
| 1 | 10×Assay Buffer | 100 μl | n×100μl |
| 2 | 灭菌水 | 795μl | n×795μl |
| 3 | ATP溶液（100×） | 10 μl | n×10μl |
| 4 | CrP溶液（100×） | 10 μl | n×10 μl |
| 5 | GAPDH溶液（200×） | 5 μl | n×5 μl |
| 6 | PGK溶液（100×） | 10 μl | n×10 μl |
| 7 | CPK溶液（100×） | 10 μl | n×10 μl |
| 8 | NADH溶液（100×） | 10 μl | n×10 μl |
7. 反应体系测定；
1.5 ml离心管中配制以下反应。
| 1 | 2 | 3 | |
| 对照反应 | 初始活性测定 | 总活性测定 | |
| MasterMix | 950 μl | 950 μl | 950 μl |
| 即用型Rubisco提取缓冲液 （步骤一） |
25 μl | - | - |
| Rubisco样品提取液 （步骤二） |
- | 25μl | 25μl 常温放置15分钟 |
| 试剂9-RuBP溶液 | 25 μl | 25 μl | 25μl |
| 加入RuBP后立即测定OD340读数，记录60秒内OD340值变化。 |
注：一般分光光度计OD340读数在0.5-3之间数据比较准确，低于此范围说明提取用的材料太少，Rubisco活性太低；高于此范围说明所用材料太多，Rubisco活性太高，此时可以将Rubisco样品提取液用即用型Rubisco提取缓冲液稀释后测定。
四、Rubisco活性计算：
根据如下公式计算样品中Rubisco活初始性和总活性：
Activity（μmol·m-2·S-1）-表示每秒每平方米叶片有多少μmol NADH被氧化
△A-反应最初1分钟内340nm处测定管吸光度变化的绝对值
N-稀释倍数，本程序中为40（1 ml提取液，取25μl测定）。
6.22-每微摩尔NADH在340nm处的吸光系数
d-cm 比色皿光程，一般为1
△t-秒 测定时间，本程序为60秒
S-cm2 提取时使用的叶面积
