固相微萃取技术测定有机磷农药与人血清白蛋白作用
固相微萃取(SPME)具有灵敏度高、无需有机溶剂等优点,已广泛应用于环境污染物分析。长期以来,农药的毒性风险评价大都是基于农药的总浓度而进行的,忽视了机体内的农药总浓度与直接作用于靶标的自由态浓度的相关性。错误地认为只要准确地测定机体中农药的总浓度,就能保证农药毒理学风险评价的可靠性,导致过高地估计了风险。而事实上,只有自由态的物质才能穿透细胞膜从而对生物产生毒理学作用,结合态有毒物质则由于极性太强或者体积太大而不能为受体所吸收,即不具有生物有效性。自由态浓度能比总浓度更好地反映污染物的生物有效性,是评价污染物生物有效性的一个关键参数。自由态浓度不仅与目标物的总浓度和基质浓度有关,而且与基质对目标物的亲和力相关。人血清白蛋白(HSA)是血浆中含量最多的运输蛋白。因此,研究农药与HSA的结合作用可以有效的评价农药的生物有效性,并且准确评价其毒性。本论文主要探索了SPME方法分析农药残留及有机磷农药与HSA结合作用。论文主要结论如下： 1. SPME方法用于水中农药多残留测定。采用直接浸入式萃取模式,PDMS/DVB萃取头萃取,气相色谱-质谱定量分析环境水中的六种酰胺类除草剂。方法具有良好的回收率(80.8%～106.4%),相对标准偏差在2.2%～17.7%。线性范围在0.01-20μg/L之间(R20.991)。检测限LOD和定量限LOQ范围分别是0.004～0.02μg/L,0.1～0.6μg/L。灵敏度可以满足欧盟和世界卫生组织(WHO)规定的地表水限量标准。 2. SPME用于HSA基质中3种有机磷农药自由态浓度的测定。对于毒死蜱,甲基对硫磷和马拉硫磷三种农药,分别使用PDMS7μm, PDMS30μm和PDMS30μm萃取头,采用外标法定量。在磷酸盐缓冲液中的萃取平衡时间分别1h(毒死蜱),40min(甲基对硫磷)和10min(马拉硫磷)。在人血清白蛋白中的萃取平衡时间分别40min(毒死蜱),40min(甲基对硫磷)和10min(马拉硫磷)。结果表明,方法的准确度和重现性均满足研究需要。 3. SPME用于有机磷农药与HSA的结合常数的测定。实验采用多个标准溶液法,将测定的自由态浓度根据单结合位点模型和双结合位点模型进行拟合。结果表明,SPME方法测定得到的结合常数(Ka)与文献值接近。模型拟合相关系数高于0.992,在37℃测定的毒死蜱,甲基对硫磷和马拉硫磷的结合常数分别为1.41×105,1.45×104和1.07×104。农药疏水性越强与HSA结合常数越大。温度越低与HSA结合常数越大。 4. SPME用于有机磷农药与HSA的结合力的测定。通过Gibbs-Helmholtz公式计算出甲基对硫磷和马拉硫磷结合作用的ΔH、ΔS以及ΔG。两种有机磷农药的△H0,说明结合反应放热,农药-HSA结合态能量低于反应物的能量。两种有机磷农药的△S值均小于零,说明结合过程系统混乱度降低,是熵减过程。ΔG值均小于零,说明结合反应可以自发进行。因此得出结论,甲基对硫磷、马拉硫磷与HSA的结合作用是氢键或范德华力。 5. SPME用于有机磷农药与HSA结合位点的测定。实验采用了标记物竞争实验证明甲基对硫磷的结合位点在ⅡA亚域；马拉硫磷的结合位点在ⅢA亚域。在加入标记物后甲基对硫磷和马拉硫磷与HSA的结合常数都有增加,说明农药与位点标记物产生了协同结合的作用。 本论文采用的SPME方法具有适用性广、分离步骤操作简便、灵敏度高、可自动化操作等优势,为研究农药与HSA结合作用以及多个配体与HSA之间的竞争和协同作用带来了全新的思路。
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