蛋白质定量/蛋白质含量的测定(考马斯亮蓝法)
实验概要
运用考马斯亮蓝法测定蛋白质的含量。
实验原理
考马斯亮蓝G-250测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。考马斯亮蓝G-250在游离态下呈红色，当它与蛋白质的疏水区结合后变为青色，前者最大光吸收在465nm，后者在595nm。在一定蛋白质浓度范围内（0～100μg/ml），蛋白质－色素结合物在595nm波长下的光吸收与蛋白质含量成正比。故可用于蛋白质的定量测定。蛋白质与考马斯亮蓝G-250结合在2min左右的时间内达到平衡，完成反应十分迅速，其结合物在室温下1h内保持稳定。该反应非常灵敏，可测微克级蛋白质含量，所以是一种比较好的蛋白质定量法。
主要试剂
1. 牛血清白蛋白 配成1000μg/ml和100μg/ml；
2. 考马斯亮蓝G-250：称取100mg考马斯亮蓝G-250溶于50ml 90%乙醇中，加入85%（W/V）磷酸100ml，最后用蒸馏水定容至1000ml。此溶液在常温下可放置一个月； 3. 90%乙醇；
4. 磷酸（85%，W/V）。
主要设备
分光光度计
10ml量筒1支
研体
10ml容量瓶1支
1ml刻度吸管3支
10ml具塞刻度试管14支
实验材料
可溶性蛋白质
实验步骤
1. 标准曲线的绘制 （1）0～100μg/ml标准曲线的制作 取6支试管，按表28-1数据配制0～100μg/ml血清白蛋白液各1ml。准确吸取所配各管溶液0.1ml，分别放入10ml具塞试管中，加入5ml考马斯亮蓝G-250试剂，盖塞，反转混合数次，放置2min后，在595nm下比色，绘制标准曲线。
表1 配制0～100μg/ml血清白蛋白液
管 号 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 |
100μg/ml牛血清蛋白量(ml) 蒸馏水量(ml) 蛋白质含量(mg) | 0 1.0 0 | 0.2 0.8 0.02 | 0.4 0.6 0.04 | 0.6 0.4 0.06 | 0.8 0.2 0.08 | 1.0 0 0.10 |
（2）0～1000μg/ml标准曲线的制作 另取6支试管，按表28-2数据配制0～1000μg/ml牛血清白蛋白溶液各1ml。与步骤（1）操作相同，绘出0～1000μg/ml的标准曲线。
表2 配制0～1000μg/ml血清蛋白血液
管 号 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 |
1000μg/ml牛血清白蛋白（ml） 蒸馏水量(ml) 蛋白质含量(mg) | 0 1.0 0 | 0.2 0.8 0.2 | 0.4 0.6 0.4 | 0.6 0.4 0.6 | 0.8 0.2 0.8 | 1.0 0 1.0 |
2. 样品提取液中蛋白质浓度的测定 吸取样品提取液0.1ml（样品提取见各酶活测定），放入具塞刻度试管中（设两个重复管），加入5ml考马斯亮蓝G-250试剂，充分混合，放置2min后在595nm下比色，记录吸光度值，通过标准曲线查得蛋白质含量。
3. 结果计算 样品蛋白质含量（mg/g鲜重）= (C*V/a)/W 式中 C－查标准曲线所得每管蛋白质含量（mg）； V－提取液总体积（ml）； a－测定所取提取液体积（ml）； W－取样量（g）。
注意事项
1．大量的去污剂如TritonX-100、SDS等严重干扰测定。 2．蛋白质与考马斯亮蓝G-250结合的反应十分迅速，在2min左右反应达到平衡；其结合物在室温下1h内保持稳定。因此测定时，不可放置太长时间，否则将使测定结果偏低。
