流式细胞术的样品制备（七种样品的制备方法）（一）
流式细胞术的样品制备
流式细胞术的实验检测对象是单细胞悬液，因此需把样品制备成细胞悬液，细胞浓度为105～107个／ml。制备成的单细胞悬液经荧光或免疫荧光标记即可上机检测。
样本制备的基本原则：1.使各种液体和悬浮细胞样本新鲜，尽快完成样本制备和检测；2.针对不同的细胞样本进行适当洗涤、酶消化或EDTA处理，以清除杂质，使粘附的细胞彼此分离而形成单细胞状态；3.对新鲜实体瘤组织可选用或联用酶消化法，机械打散法和化学分散法来获得足够数量的单细胞悬液；4.对石蜡包埋组织应先切成若干40-50μm厚的蜡片，经二甲苯脱蜡到水后，再用前述方法制备单细胞悬液；5.单细胞悬液的细胞数不应少于107个/ml。
一、新鲜实体组织样本的制备
（一）酶处理法 此法是实体组织分散为单个细胞的主要方法。由于不同酶对细胞内和细胞间不同组分有特异消化作用，所以应根据所用组织类型确定使用酶的种类。此外，乙二胺四乙酸(EDTA)能结合组织中的二价钙离子和镁离子，而二价钙离子和镁离子有维持细胞表面完整性和维持细胞间质结构的作用，因此，几种酶和EDTA联合使用有助于充分消化实体组织，提高细胞产出效率。下面仅介绍组织消化的一般过程，对于每种组织消化时所用的具体步骤需参考该组织细胞培养时的消化方法。
1．将组织剪成l～2mm3左右的小块。
2．用胰蛋白酶或胶原酶消化组织块，胰蛋白酶适用于消化细胞间质较少的软组织，如胚胎、上皮、肝、肾等组织。胰蛋白酶工作浓度一般为0．1％～0．5％。对于纤维较多的组织或较硬的癌组织常用0．25％胶原酶，胶原酶对组织中胶原蛋白类结构消化作用强，它仅对细胞间质有消化作用而对上皮细胞影响不大。胶原酶常用剂量为0．1～0．3ug／ml。用大于组织量30～50倍的胰蛋白酶液或胶原酶液在37℃条件下消化组织，需每隔一定时间摇动一次。消化时间的长短依组织类型而定，一般来说，胰蛋白酶需作用20～60分钟，胶原酶需4～48小时。在消化过程中，如发现组织块已分散而失去块的形状，经摇动即可成为絮状悬液，则可取出少量液体在显微镜下观察，可见分散的单个细胞和少量的细胞团，可认为组织已消化充分。
3．消化完毕后，将细胞悬液通过100目孔径尼龙网或不锈钢网滤过，以除掉未充分消化的组织。
4．已过滤的细胞悬液经800～1000rpm低速离心5～10分钟后，弃上清液，加PBS液，轻轻吹打形成细胞悬液，细胞计数后即可使用。
（二）机械法 机械法分散实体组织，用手术剪刀剪碎组织、用锋利的解剖刀剁碎组织或用匀浆器制成组织匀浆，再用细注射针头抽吸细胞或用300目尼龙网滤除单细胞悬液；采用网搓法也能获得大量细胞。机械法易造成细胞碎片和细胞团块，所以常与其他方法配合使用。
1．剪碎法
（1）将组织块放入平皿中，加入少量生理盐水；
（2）用剪刀将组织剪至匀浆状；
（3）加入10ml生理盐水；
（4）用吸管吸取组织匀浆，先以100目尼龙网过滤到试管中；
（5）离心沉淀1000r/min，4~5min，再用生理盐水洗3遍，每次以低速（500~800r/min）短时离心沉淀去除细胞碎片。
（6）以300目尼龙网滤去细胞团块；
（7）细胞用固定液固定或低温保存备用。
2．网搓法
（1）将100目、300目尼龙网扎在小烧杯上；
（2）把剪碎的组织放在网上，以眼科镊子轻轻搓组织块，边搓边加生理盐水冲洗，直到将组织搓完；
（3）收集细胞悬液，500~800r/min离心沉淀2min；
（4）固定细胞或低温保存备用。
3．研磨法
（1）先将组织剪成1~2mm2 大小组织块；
（2）放入组织研磨器中加入1~2ml生理盐水；
（3）转动研棒，研至匀浆。
（4）加入10ml生理盐水，冲洗研磨器；
（5）收集细胞悬液，并经300目尼龙网过滤，离心沉淀500~800r/min，1~2min，再以生理盐水水洗3遍，离心沉淀；
（6）固定或低温保存细胞悬液，备用。
二、组织活检、内镜取材标本单细胞悬液的制备
正常组织、瘤组织和淋巴结等活检组织以及内镜（胃镜、食管镜等）取材标本，由于材料较少、制备起来比较麻烦，但其制备方法与实体组织基本相似。
1．取材后立即放入盛有少许PBS液的青霉素小瓶中；
2．另取一只小烧杯，杯口用300目尼龙网盖住，用线绳固定好，并用PBS液湿润；取新鲜组织标本置尼龙网上，因标本量少，尤其是内镜取材至少要取3块以上。
3．在操作前，先将剪刀用PBS液浸润一下，然后开始剪碎组织；
4．先剪几下，视基本无组织块存在时，用原来装标本的青霉素小瓶中的PBS液，冲洗细胞匀浆并过滤于小烧杯中，如果这时仍有可见组织块，再用剪刀剪碎，再加适量该PBS液冲洗，直至网上无组织块为止。这样可尽量多地收集细胞。
5．细胞加固定液或低温保存，备用。
三、石蜡包埋组织的流式细胞样品制备
外科手术获得的新鲜实体组织，往往已进行石蜡包埋处理。石蜡包埋组织单细胞分散方法的建立，扩大了流式细胞术的应用范围。
1．把石蜡包埋组织切成10~50um厚的组织片3~5片，或用乳钵研成0.5mm直径大小颗粒状，放入10ml的试管中；
2．加入二甲苯5~8ml，在室温下脱蜡1~2天，视石蜡脱净与否，更换1~2次二甲苯，石蜡脱净后，弃去二甲苯；
3．水化：依次加入100%、95%、70%、50%梯度乙醇5ml，每步为10min，去乙醇，加入蒸馏水3~5ml，10min后弃之；
4．消化：加入2ml 0.5%胰蛋白酶（pH 1.5~2.0）消化液，置37℃恒温水浴中消化30min，在消化期间，没隔10min用振荡器振荡1次；
5．消化30min后，立即加生理盐水终止消化；
6．经300目尼龙网过滤，未消化好的组织可做第二次消化；
7．收集细胞悬液，离心沉淀1500r/min，再以生理盐水洗涤1~2次，离心沉淀500~800r/min，去碎片；
8．保存细胞备用。
