Native-PAGE(非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳)的分类-2
1.3.3 实验方法
（1）储备液
1）200mM Tris-HCl 10mM NaN3 PH10.00，室温
2）200mM Tris-HCl 10mM NaN3 PH8.00，室温
3）40%丙烯酰胺/双丙烯酰胺2.67C，4℃（新鲜）
（2）电泳缓冲液
20mM Tris-HCl 1mMNaN3 PH10.00（除气），4℃
电泳槽上部：500ml电泳缓冲液
电泳槽下部：2000ml电泳缓冲液
（3）洗脱液
20mM Tris-HCl 1mMNaN3 PH8.00（除气），4℃
洗脱室：700ml洗脱缓冲液
（4）分离胶
丙烯酰胺4%T 体积40ml
成分：
4ml40%丙烯酰胺/双丙烯酰胺2.67C
4ml 200mM Tris-HCl 10mM NaN3 PH10.00
32 mL H2O
200 μL 10% APS
20 μL TEMED
APS和TEMED最后加入。轻轻搅拌烧瓶中的混合物，注意不能产生气泡。然后把溶液移入内径为28mm，长为40mm有刻度的玻璃柱中。加入 3ml正丙醇。60分钟聚合后用电泳缓冲液冲洗凝胶，然后用4ml电泳缓冲液覆盖凝胶表面。在室温下凝集69小时。
（5）样品的准备和收集
保持样品（生物液体）温度为4℃。0.3ml甘油和2.7ml样品在分离前混合5分钟。然后把处理好的样品加入到电泳缓冲液的上层。这些蛋白在此电泳缓冲液中不是带负电（PI<10.0）就是带负电（PI>10.0），因此在电场中不是从正极迁移到负极就是从负极迁移到正极。已分离的蛋白分子用特殊的生理洗脱液连续洗脱，并用分部收集器收集。整个分离系统必须在4℃冰箱中进行。
纯化的，半纯化的和未处理的样品都可以用于QPNC。样品分离纯化中应该避免类似于蛋白质沉淀等过程以防止蛋白变性。化学稳定的金属蛋白可以用非变性的凝胶渗透层析来进行进一步纯化。
1.3.4 定量和鉴定
Fe， Cu， Zn， Ni， Mo， Pd， Co， Mn， Pt， Cr， Cd和其它金属辅因子可以通过ICP-MS（Inductively
coupled plasma mass
spectroscopy，电感耦合等离子体质谱）来定性和定量。因为PAGE条带的高纯度和选择性凝集，相关的结构可以用非变性条件下的NMR来分析。
1.3.5 应用
QPNC的应用对象为分子量6-200kDa的酸性、碱性和中性金属蛋白。在测定血液或其它临床样品中独立的金属蛋白结构和功能关系方面具有重要应用，因为不正确的金属陪伴蛋白的折叠。例如超氧化物歧化酶（SOD）的铜陪伴蛋白出现在这些基质中或许预示着神经病变疾病如肌萎侧索硬化病等。QPNC-
PAGE，SEC，ICP-MS和NMR等技术的连用可以得到病人或潜在的病人液体基质中相关金属蛋白的生理状态的结构。这一技术可以提高蛋白错折叠相关疾病的诊断和治疗水平。
