RT-qPCR常用的SYBR@Green I双链DNA结合染料的应用
随着新冠病毒肆虐全球，聊病毒是个敏感话题。今天我们就从这个敏感话题着手，好好聊一聊。
病毒是一种个体微小，结构简单，只含一种核酸（DNA或RNA）。我们现在提起来就咬牙切齿的的新冠病毒（COVID-19），就是一种RNA病毒。当然除了COVID-19，我们常听到的其他臭名昭著之辈，如艾滋病病毒、流感病毒、登革热病毒、烟草花叶病毒、噬菌体等均属于RNA病毒。这些RNA病毒让之所以让我们谈虎色变，是因为很多RNA病毒具有非常强的侵略能力，会严重影响宿主生命活动。如何精准地检测到病毒（定性）？如何有效判定出样本中的病毒含量（定量）？借助分子生物学技术可以精准检测病原体，其中的一步法RT-qPCR技术可被广泛用于RNA病毒类型判定、病毒亚型判定、病毒定量及病毒突变体等方面，广泛用于食品安全、动物疫病、疾病诊断与治疗效果评估等临床与公共卫生等领域。
一步法RT-qPCR(One-Step reverse transcription-quantitative PCR)用于以RNA为起始模板的定性和定量分析，将RNA逆转录合成cDNA的过程与靶标基因的PCR扩增于一管内依次进行，利用荧光来监控PCR扩增产物的变化，进而判断RNA初始量的技术即为一步法RT-qPCR技术。RT-qPCR根据化学发光原理可以分为两大类：一类为染料类，包括SYBR@Green I，通过荧光染料来指示产物的增加；一类为探针类，包括TaqMan@探针，利用与靶序列特异杂交的探针来指示扩增产物的增加。
染料法：
常用的SYBR@Green I是一种结合于小沟中的双链DNA结合染料，与双链DNA结合后，其荧光大大增强。这一性质使其用于扩增产物的检测非常理想。SYBR@Green I 的最大吸收波长约为497nm，发射波长最大约为520nm。在PCR反应体系中，加入过量SYBR@Green 荧光染料，SYBR@Green荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR@Green染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。
作为全球最大的克隆供应商之一，GeneCopoeia提供的BlazeTaq™ One-Step SYBR® Green RT-qPCR kit是基于SYBR Green 染料法的Real Time One-Step RT-PCR反应试剂。试剂盒以RNA为模板，逆转录反应和定量检测可在同一反应管内完成，简化操作的同时可有效降低污染的风险。试剂盒包含了性能优异的逆转录酶，以及含有热启动Taq DNA聚合酶、dNTP和必需的缓冲液成分混合而成的5×预混液。在逆转录酶作用下RNA逆转录成cDNA，并使用抗体修饰的Taq DNA聚合酶进行Real Time PCR反应，抗体的完全封闭有效避免了聚合酶在热循环反应前被激活。另外，经优化的Buffer体系大大提高了PCR反应的扩增效率和特异性，且检测灵敏度可达0.1pg总RNA，适用于各类型RNA模板的检测。
一步法RT-qPCR染料法荧光定量试剂盒优势：
灵敏度高：可从低至0.1pg的RNA提取物中精确检测目标RNA。
特异性强：有效抑制引物二聚体及非特异性扩增的产生。
扩增效率高：在宽广的GC含量范围内能维持高扩增效率。
