单细胞技术分类及应用（二）
什么是OEP呢？
OEP的前身是2018年诺贝尔物理学奖获得者之一的Ashkin发明的Optical Tweeszer（OET）光镊技术，其原理是利用单个激光束通过高倍的显微物镜聚焦形成光阱，微观粒子受光压而束缚在光阱处，使用皮牛级别的力操纵和移动陷入光阱的微观粒子。这项技术在生物学上为单细胞的高分辨实验研究提供了强有力的工具，不过它被限制在需要较高强度的激光强度，且难以同时操作多个细胞要求上，此外，高的光源能量强度也会导至损坏细胞以及限制了实验持续时间。为了克服这些局限，新的光电定位技术 OEP被研究开发了出来，通过OEP技术，利用光束同时在光敏感材料上产生电势场，它能够同时并且大量的操控单细胞，并且OEP允许较低的光源能量，可以在更大的处理面积进行实验。这一技术需要光学器件和配套的芯片组件的结合来完成，如下图所示：
图5 BLI Optofluidic Platform中所使用的OEP技术原理
整个OEP部件由光学系统和光敏感材料组成。光源经过透镜选择性地照射到目标位置。入射光在基于氢化硅的光导电极作用下，在照射部位的上方空间产生局部的电场，产生电场力。通过调整入射光的位置，推动该位置的颗粒（如细胞）移动。这种光电定位OEP技术配合微孔外的微流，即可实现不依赖于荧光染料标记的活细胞定向分选和收集到纳升级培养小室Nano-Pen中。
更可喜的是，Nano-pen中在提供单细胞分选和在线分析的同时也提供单细胞培养所需的环境。最终该核心芯片被仪器的硬件系统集成到一个自动化样本库大小的设备中，包括供电系统、空气和CO2的供应管路、以OEP为基础的定位系统、放置芯片的卡槽及配备的温控培养系统、用于细胞运输和液体交换的微流控系统等。除此之外，还有检测系统的软件部与硬件相配套，用于通过对仪器部件的操作来运行实验和通过对检测元件的操作来实现特定数据的收集。因此BLI技术平台的工作流程大致是：第一步，单细胞的运输和OEP向纳升级培养小室Nano-Pen中的分选；第二步，单细胞的选择性培养；第三步在线On-Chip分析；第四步，特定Nano-Pen中的细胞输出。其中的第三步，即在线检测实验，与特定课题或项目的要求相匹配，可灵活设计，这也是该技术平台的普适性的重要体现。
Berkeley Lights单细胞光流体平台的应用
目前BLI的单细胞光导流体平台强大的功能具体应用的领域包括抗体发现、细胞克隆筛选、细胞系构建、细胞治疗研究等，具有广阔的应用前景。下图给大家展示的是应用于抗体药物发现和抗体表达细胞株构建的工作流程。
图6 BLI技术平台在抗体发现和稳转细胞株构建方面的应用
显而易见，BLI技术平台的运用，能够从技术层面明显缩短整个项目开发所需要的时间，同时平台所实现的整合、集约化和可实时监控的工作流程使得研发工作变得紧凑而高效，更加便于制药企业以及CRO或者研究单位的项目管理。
除了生物制药领域，在当前比较火热的肿瘤免疫治疗领域，BLI单细胞光流体技术也提供了一体化进行抗原特异性T细胞的单细胞分选以及在线实时分析T细胞增殖、表型、细胞因子及杀伤力等多参数综合分析免疫系统功能平台，为单个细胞水平的免疫学研究提供了一套最直接的全面及高效的研究方法。
图7 实时单个T细胞水平的活性检测实验到目的细胞/细胞群体导出
除了T细胞表型和功能信息的活性评估检测之外，T细胞表面受体（TCR）序列对T细胞相关研究来说也比较关键，TCR基因序列可以准确地描述了T细胞在包括恶性肿瘤、自身免疫性疾病和传染病等多种疾病中的动态，决定着人的免疫系统如何适应环境的变化，具有很大的科学价值。正常T细胞在没有抗原刺激的情况下，TCR基因的重排是随机的，而接受相应抗原刺激后，TCR特别是其可变区V区基因对抗原产生特异性识别，并使带有这类基因的T细胞得到优势扩增，而T细胞领域的研究者们往往最后更关注就是拿到这样的TCR的序列。BLI单细胞光流体技术可以助力TCR相关的免疫基因组学研究，帮助研究者将分析评估后的目的T细胞/单个T细胞克隆群体选择性的导出用于进行后续的下游实验如T细胞受体（TCR）测序等操作。
图8 BLI 技术平台上TCR Discovery的流程的优化
TCR 开发流程极大的简化并改进了现有复杂繁琐的方法，仅仅利用2天时间即可在线一体化的完成原来1-3个月时间里面完成的特异性T细胞高效分选（TCR筛选）及克隆和功能验证试验，帮助研究者们在最短的时间里面找到最佳的可有效结合靶抗原的T细胞抗原受体（TCR Candidates），最终直接关联下游测序流程帮助研究者们后直接获得特异性识别肿瘤抗原的TCR序列进行TCR药物开发或者用于疫苗研究等。
当然不仅仅是TCR开发，在其他T细胞修饰等技术的相关应用中都以其独特的单细胞水平的研究方式帮助研究者们去将T细胞及其受体的改造后的活性功能分析、培养、克隆等工作流程实时高效的开展完成，以数字细胞学的方式大大的加速了整个细胞生物学研究的进程。
图9 BLI单细胞技术快速评估基因编辑T细胞表型（Nature期刊）
展望
单细胞层面的研究已是生物技术大行业的大势所趋，为这样的趋势提供强有力的技术支持，无论对于行业还是对于企业自身，都是一件极有意义和前景的事情。小编相信，这些技术平台未来在基础研究的层面将会大有可为，在产业界的医药产品开发中也会发挥越来越重要的作用。
参考文献
1.High-throughput single-cell ChIP-seq identifies heterogeneity of chromatin states in breast cancer，Nature Genetics volume 51, pages1060–1066 (2019)
2. Single human B cell-derived monoclonal anti- Candida antibodies enhance phagocytosis and protect against disseminated candidiasis，Nature Communications volume 9, Article number: 5288 (2018)
3. A Microfluidic Platform for High-throughput Single-cell Isolation and Culture. Journal of Visualized Experiments, 2016(112).
4. Light-activated cell identification and sorting (LACIS) for selection of edited clones on a nanofluidic device, Nature Communications Biology, Article number: 41 (2018).
