选择合适尺寸排阻色谱法分离蛋白质—选择合适的色谱柱
（1）粒径和柱长
在近年来SEC色谱柱技术得到发展之前，大多数使用的SEC色谱柱的直径通常相对较大，通常为7.8 mm，长度为150至300 mm。由于使用了较大的颗粒，因此需要较长的色谱柱长度，其中大多数颗粒的机械强度不高，必须在相对较低的压力下使用。SEC色谱柱技术的最新趋势集中在开发具有更小的颗粒（<3 µm），更短的色谱柱（现在的标准是15 cm）和更小的直径（通常为4.6 mm）的色谱柱。颗粒化学的发展支持了这种趋势，这些化学既具有足够的机械稳定性，可以在较小的颗粒尺寸的较高压力下使用，又对生物分子呈惰性，从而主要基于分子尺寸进行分离。通过使用更高的流过这些色谱柱的流速，也可以减小粒径，从而提高分离速度。对于较大的颗粒，使用高流速往往会导致效率（即塔板数）和分离度降低，但是对于较小的颗粒，这样做所付出的代价并不那么严格。
（2）平均孔径和分布
如上所述，特定分子通过SEC柱的速度取决于它可以探索颗粒孔的程度。对于具有明确定义的孔径分布的颗粒，存在特定分子对于基于尺寸的分离有效的分子尺寸范围。图1中所示的校准曲线显示了具有不同平均孔径的颗粒的选择性（即，给定分子量变化下洗脱体积的差异）。我们看到，小孔色谱柱对小分子具有良好的选择性，但最大的分子将被有效地共洗脱。另一方面，非常大的孔材料有效地分离了最大的分子，但最小的分子却被共洗脱。这种类型的图可用于确定哪种孔径对手头的应用最有效。对于蛋白质表征，通常使用的孔径在150至500Å之间。对于常见的治疗性蛋白质（MW≈15–80 kDa），孔径为150–200Å效果很好，而单克隆抗体（mAbs，MW≈150 kDa）通常使用孔径为200–300Å。对于非常大的蛋白质（分子量> 200 kDa，例如，聚乙二醇化酶或聚乙二醇化的蛋白质），通常500-1000Å的材料可提供最合适的选择性。
