设计cas9条件性基因敲除小鼠
其关键是构建带有两个Loxp位点的小鼠，即flox(flanked by loxP)小鼠。
今天我们就来详细介绍一下如何设计。
共分三步：
第一步，选择外显子。
第二步，设计sgRNA。
第三步，设计SSODN。
听起来蛮简单的哈？下面我们详细讲讲。
第一步，选择外显子。
1. 尽量选择敲除所有转录本共用的外显子。
我们都知道，真核生物的基因是有外显子和内含子的，利用这些内含子和外显子，一个基因可以剪接出多个转录本，翻译后得到多个蛋白。设计条件性敲除的时候，首先要搞清楚这个基因有几个转录本，一般敲除所有转录本共用的外显子。
2. 该外显子的碱基数一定不要是3的倍数。
这样才能造成整个基因编码的所有蛋白都移码突变，起到敲除基因的效果。
3. 最好不要选择第一个外显子。
为啥？ 因为基因可能利用附近其它地方的起始密码子来起始转录。这样你辛苦敲掉了第一个外显子，而蛋白可以从别的地方重新开始翻译。就不能达到基因敲除的效果。
第二步，设计sgRNA。
在选定了外显子后，就可以开始设计sgRNA了。sgRNA的结构如下图所示。A图显示的是平面序列信息。B图显示的是三维立体构象。sgRNA由两部分构成，即绿色的目标序列部分，红色和蓝色组成的骨架部分。起的作用是指导cas9蛋白在基因组上的特定位置进行剪切。所以可见，sgRNA的核心部分主要是绿色部分。所以设计sgRNA的关键是选定绿色目标序列的位置。针对条件性基因敲除小鼠，一般选择的区域是该外显子相邻的两个内含子中。sgRNA的设计原则：
1. 在基因组上相似的序列最少。
目的是为了将脱靶效应降到最低。
2. 要有NGG。
这是目前最常用的Cas9蛋白识别靶位点所必须的。
这里可以利用许多在线设计网站，找到合适的位点。
引自Cell 156, 935–949, February 27, 2014
第三步，设计SSODN（Single-Stranded Oligo Donor）。
SSODN的排列顺序是这样的：同源臂+酶切位点+ loxp位点+同源臂。
1. 同源臂
一般是选择断裂点上下游各选40-60bp作为同源臂。具体操作，可以参考下图。
2. 加入酶切位点
加入一个酶切位点也是为了方便验证，不加也没啥。
3. Loxp位点的方向
有一个点非常重要，就是34bp的loxp位点是有方向的，一定要方向一致，否者当你经历了千山万水拿到小鼠准备敲除基因的时候，你会发现你想敲除的片段只是掉了个头，还在那里。这时候就是想死的心都有了。哈哈，别怪我没提醒噢。
4. SSODN和sgRNA位于同一条链上。
还有一点就是，最好让SSODN和sgRNA处在同一条链上，否则，你的sgRNA还没有发挥作用，就已经被SSODN给霸占了。这样的话，人家干活是有情绪的。
引自Cell 154, 1370–1379, September 12, 2013
第四步，行动。
如果你已经走到这里，恭喜你，你已经完成了设计工作，you really can了。
但这才是“万里长征走完了第一步”。
接下来就是引物设计，SSODN的合成，体外转录，验证sgRNA，显微注射，F0验证，小鼠杂交等等... ...
这时，“一大波实验正在向你靠近”!
