上样质控和抗体验证用于Western blot定量
今天的帖子的灵感来自于我和同事在教他们SDS-PAGE和western blot的实验交谈中。 他们对于qRT-PCR（R）和流式细胞术（R）精通，特别关心如何以及为什么使用某些上样质控，还有其它的技术被使用验证，蛋白质表达和抗体特异性的变化。
样品准备和上样质控
理想地，上样质控是多步骤过程的一部分，以确保将标准量的蛋白加载到所分析的每个样品的凝胶上。 分离样品的第一步通常是进行蛋白测定，BCA和Bradford测定法是最流行的两种，允许在开始测定之前标准化样品浓度。 第一步的几个技术问题，排除污染物质的干扰，准备或者分离样本。 考虑到这个原因，应与蛋白质测定一起考虑其预分离标准化技术，例如使用恒定样品量或细胞数。
一旦样品开始分离和转移，经常被忽视的对照是要进行膜染色，我在前一篇文章中讨论过。 免染胶和丽春红染色是检验转移效率的一种很好的验证技术，但是如果加载了相等量的样品，样品也应该看起来大致相似。 利用现代图像采集和分析技术，还可以使用丽春红（R），考马斯蓝（R）和免染方法（R）进行基于蛋白质（R）的总蛋白定量。 然而，由于在转印后进行丽春红染色，与PVDF和硝酸纤维素膜结合，并且也很容易洗掉，因此很难将其推荐到其他技术上。
所以，加载上样质控。 大多数人都喜欢用beta-actin和GAPDH作为内参。 然而，应该考虑组织类型，感兴趣的蛋白定位和大小，因为在文献中有许多实例证明加载内参确实变化很大（R，R，R）。 这是一个很好的资源，详细说明了一些加载内参以及其分子量和细胞定位，但是需要阅读文献来评估以前的研究。
然而，在样品制备和分析western blot定量过程中执行所有三个质控步骤，蛋白定量应变得轻而易举，特别是如果使用生物成像系统进行多重标记成像，允许上样质控和感兴趣的样品同时显现，总蛋白定量和校正。
Western blotting中的抗体质控
抗体对照，在Western blotting中，与FACS或免疫组织化学（IHC）等其他基于抗体的技术相比，这一领域通常被忽略。 部分原因是由于电泳期间蛋白质的分离，这使得确定抗体特异性更容易。 然而，总是值得考虑引入对照进行验证的重要性，特别是对于印记膜的定量。
阳性和阴性
阳性对照是Western印迹中最广泛使用的，有几种类型可用。 全长重组蛋白质作为理想的阳性对照，因为它们应该与天然蛋白分离是相同的，如果产生标准曲线，也可以用作进一步定量的标准品。 然而，重组蛋白不能使用的，因为成本可能是令人望而却步的。 在这些情况下，可以使用阳性细胞或组织样品，包括已被修饰以过度表达感兴趣的蛋白的样品。
在另一个方向上，阴性对照样品也可能被用上，使用完整的空白，更好的对照是缺乏目的蛋白的裂解物。 如果感兴趣的蛋白质是相对组织特异性的，或者可以通过敲除产生。
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综述
