再扩增VH基因文库添加3‘限制性位点并克隆创建VH基因节...
再扩增VH基因文库添加3‘限制性位点并克隆创建VH基因节段文库
[器材和试剂]
● PCR试剂和设备
● Wlzard PCR纯化试剂盒（Promega）
● PVHlOR2引物： 5'-GAG TCA TTC TCG ACT TGC GGC CGC TCG CGC GCA GTA ATA CAC GGC CGT GTC-3,
● PVH3FOR2引物：5'-GAG TCA TTC TCG ACT TGC GGC CGC TCG CIGC GCA GTA ATA CAC AGC CGT GTC CTC-3'
● PVH5FOR2引物：5'-GAG TCA TTC TCG ACT TGC GGC CGC TCG CGC GCA GTA ATA CAT GGC GGT GTC CGA-3'
● 胶纯化VH基因文库 （25ng/ul）
● 用于scFv基因文库限制性消化的试剂和设备
● 用于连接scFv和pHENl DNA以及将scFv文库电转化到大肠杆菌的试剂和设备。
[方法]
1. 配制3个各自独立的50ul PCR反应混合液，包含：
● 水，34.5u1
● 20×dNTPs（每种5mmol/L）， 2.5ul
● 10×Vent聚合酶缓冲液，l 0ul
● LMB3引物（10pmol/u1），2.5ul
● FORWARD引物 （10pmol/ul），2.5u1
● VH基因文库 （25ng/u1），2.0u1
● Vent DNA聚合酶（2单位），1.0ul
2. 在有加热盖的热循环仪内加热反应物到94℃ 5分钟。
3. 以94℃30秒、42℃30秒、72℃1分钟的条件共循环25次，再次扩增VH基因。
4. 用Wlzard PCR纯化试剂盒纯化PCR产物。
5. 用NcoI和NotI消化PCR产物。
6. 将消化的PCR产物连接到NcoI/NotI消化的pHENl中，并电转化到大肠杆菌TGl细胞中，建立3个VH基因片段噬菌体丈库。测定文库容量并将细菌性丈库材料储存于-70℃。
7. 从每种VH基因文库中制备DNA:用含甘油丈库储存材料细菌接种到含l00ug/m1氨苄青霉素和1%葡萄糖的100m1
2×TY培养基中。接种量应足够大以保证接种细菌数至少比文库容量大5倍。过夜培养后，按标准的DNA质粒制备方法进行操作。为了续后进行文库消化，可合并不同丈库的DNA.
