花序真空渗透法转化拟南芥及其抗性筛选
实验概要
本实验利用了花序真空渗透法转化拟南芥，并进行了抗性筛选。
主要试剂
卡那霉素，YEB培养基，菌株EHA105，1/2 MS液体培养基，表面活性物质L-77 Silwet
主要设备
摇瓶，摇床，高速离心机，生长室
实验步骤
1. 将表达载体pBI121::AtMYBl，导入农杆菌EHA105
本研究选用农杆菌介导的基因转化方法。我们将转化单元导入Agrobacterium tumefaciens EHA105中，涂YEB板(含卡那霉素Km 50 ug/ml )，28℃倒置培养约48 h。提取质粒并酶切验证，获得转化成功的菌株，供转化拟南芥使用。
2. 花序真空渗透法转化拟南芥及其抗性筛选
1) 将活化的带有pBI121::AtMYB15质粒的A. tumefacien，菌株EHA105在YEB液体培养基(含Km 50 ug/ ml )中于28℃摇瓶培养过夜；
2) 按1%的量转接，大量摇瓶培养至OD600约为0.7；
3) 4℃，5000 rpm离心10 min，收集菌体；用1/2 MS液体培养基洗涤沉淀，再按上述条件离心，收集菌体；
4) 然后用1/2 MS液体培养基悬浮菌体至109cfu/ml；
5) 待Col-0生长到盛花期时，将盆钵倒置，使拟南芥花浸入上述菌悬液中(含0.02%表面活性物质L-77 Silwet )，真空抽滤15 min，使菌液渗入花中；
6) 取出后于生长室中继续培养至种子成熟，收种。
7) 由于拟南芥开花时间不一致，可重复抽滤3-4次。
8) 用Km抗性筛选沉默植株，在MS Km ( 50 ug/ml)的平板上生长约12d后，挑选生长正常且根较长的绿色幼苗(T0代)移栽到土壤中，正常培养。
9) 种子成熟后进行单株收种(T1代，具有RR，Rr，rr型)，T1代种子继续在Km抗性平板上筛选，根据孟德尔遗传第一定律统计分析，筛选获得T2代纯合品系。
