毕赤酵母遗传霉素抗性转化子的筛选
实验概要
本实验介绍了毕赤酵母遗传霉素抗性转化子的3种筛选方法。
实验步骤
1. (去壁细胞)方法：从含HIS 转化子的平板开始
1) 用灭菌刮片将含有HIS 转化子的顶层琼脂最上层刮下，放入无菌的50ml 离心管中。
2) 加入10-20ml灭菌水，量应为琼脂的两倍，剧烈振荡1-2min。
3) 将离心管置于管架上，让琼脂沉淀(1min)。
4) 用血球计数计确定上清中细胞浓度。至少要5×105细胞/ml，那样在200ul 或更少溶液中可含105 个细胞。(如果太稀，可将液体转入另一管中，离心细胞，再用适量灭菌水重悬至5×105细胞/ml)。
5) 每块含遗传霉素的YPD 平板涂105细胞。每个浓度用四块板。(需要证实在没有遗传霉素的YPD 板上细胞的滴度，计算每个遗传霉素抗性平板上抗遗传霉素克隆的比例，以确定你所得到的多拷贝子是否占平板上转化子的1-10%，将收集的转化子稀释到10-5，10-6，10-7浓度，每板加100-200ul)。
6) 在30 度孵育平板，每天检查。抗遗传霉素克隆需2-5 天出现，不含遗传霉素的YPD平板上克隆需2-3天出现。接下来做结果分析。
2. (电转化)方法：电转化毕赤酵母时用以下程序。转化子不需要铺在上层琼脂。从含HIS 转化子平板开始。
1) 吸取1-2ml 灭菌水于所有HIS 转化子平板上。
2) 用灭菌刮子重悬HIS 转化子，不要划破琼脂。
3) 将细胞悬液集中转移至灭菌的50ml 离心管中，稍涡旋(5-10S)。
4) 用分光光度计测定浓度(1OD600=5×107细胞/ml)。
注意：混有琼脂会干扰读数
5) 在每块含有遗传霉素的YPD 平板上涂105细胞。(需要证实在没有遗传霉素的YPD 板上细胞的滴度，计算每个遗传霉素抗性平板上抗遗传霉素克隆的比例，以确定你所得到的多拷贝子是否占平板上转化子的1-10%，将收集的转化子稀释到10-5，10-6，10-7浓度，每板加100-200ul)
6) 在30 度孵育平板，每天检查。抗遗传霉素克隆需2-5 天出现，不含遗传霉素的YPD平板上克隆需2-3天出现。接下来做结果分析。
注意：如果在以上方法里你将所有细胞都悬浮，加15%灭菌甘油，存于-80度，可在以后时间里做遗传霉素抗性筛选。
3. 方法：需要三组各两块微量测定板(共6 块)来筛选180 个HIS 重组子。通过持续接种，得到相同浓度的克隆子，以确保遗传霉素平板上细胞数相等。如将转化子铺于顶层琼脂中，有必要从琼脂上收集细胞，重新涂最小组氨酸平板(P42)以收集克隆。记住要有菌株背景对照及单拷贝基因对照。每180个克隆，可选择出1-10个抗遗传霉素克隆。
1) 无菌条件下，在每个微量测定板上加入200ul YPD。
2) 用灭菌牙签在第一组平板中每孔接种单个HIS 转化子，轻轻搅动以悬浮细胞。
3) 盖住微量测定板在30 度孵育2 天(不需摇动)。
4) 2 天后，取新的微量测定板，加入190ulYPD。
5) 用多道移液器吸取10ul 培养液于第二组测定板中，确保第二组板标记好并放置好，这样可指示细胞所在孔。
6) 盖住第二组板，30度孵育过夜。
7) 第二天，在第三组测定板上重复第5，6步。
注意：持续生长及传代可使克隆达到相同细胞浓度。
8) 孵育后，取第三组板，用100ul 多道移液器上下吹打重新悬浮细胞。
9) 取10ul每孔中液体点在含遗传霉素浓度为0，0.25，0.5……4.0mg/ml 的YPD 平板上。用多道移液器或在平板底下划线，确保以规则方式排列。
10) 待液体吸收，将板放于30 度，2，3，4，5 天后检测抗遗传霉素克隆，接着分析结果。
注意事项
用遗传霉素筛选可能会有假阳性。划线挑取假定的抗遗传霉素单克隆，然后在YPD-遗传霉素平板上进行证实很重要。如果你真的选择复制平板，一定要证实遗传霉素抗性。开始前：准备10 个YPD 平板，每个的遗传霉素浓度为0，0.25，0.5，0.75，1.0，1.5，1.75，2.0，3.0及4.0mg/ml。
