将B细胞重编程为功能性T淋巴细胞研究（一）
来一个关于B细胞重新编程为T细胞的精彩故事^_^且听我慢慢讲来[1] ……
目前已经有很多研究证明通过特定转录因子的表达可以将多能或多能细胞导向分化成特定类型的细胞或从一个谱系转变为另一个谱系。比如Gata1的表达将单核细胞前体转化为红系-巨核细胞和嗜酸性粒细胞[2-4] ，Cebpα将B细胞转化为巨噬细胞[5]; 删除Pax5将B细胞转化为未定型的造血祖细胞[6,7]; Gata3的表达将T淋巴细胞转化为肥大细胞[8]; Cebp±和Spi1的表达将T淋巴细胞转化为巨噬细胞和树突状细胞[9]，Bcl11b的缺失将T淋巴细胞转化为自然杀伤样细胞[10]。但是尝试通过沉默B细胞关键的转录因子，将B转换为T细胞只取得了有限的成功，因为无法在功能上重建整个T细胞谱系，并且在某些情况下，这种操作会增加癌化的风险[6,7,11,12]。但通过以往这些研究，总的来说造血细胞的命运是可以通过基因操作来改变的。
但是到底是哪些转录因子重点参与了细胞间的转化呢？
15个转录因子的异常表达与B细胞重编程为T细胞相关
为了找到这些关键的转录因子，研究人员首先采用RNA-Seq鉴定了成熟完全定型的谱系细胞与Hematopoietic stem cells（HSC）和multipotent progenitors（MPP）中差异表达的转录因子。如果基因在HSC和MPP中的相对表达量比在谱系细胞中高2倍(P< 0.05)，则被指定为在HSC和MPP中差异表达的基因。研究人员筛选出15个在造血干祖细胞高表达的转录因子，它们在HSC和MPP中表达，但未在谱系定型的细胞中表达[图1] ，研究人员推断这些因子在Pro-pre-B细胞中过表达有可能改变该细胞类型的命运。
候选基因初步筛选出来了！我们如何验证这一推断呢？
科学家们将15种转录因子中的每一种克隆到逆转录病毒表达载体中，调整成相同的感染滴度后，混合感染纯化过的Pro-pre-B细胞[图2a]，使感染的Pro-pre-B细胞表达GFP荧光蛋白（TFs），以感染表达GFP空载体的Pro-pre-B细胞为对照（Ctr）[图2b] ，然后移植到清髓预处理的野生型受体小鼠[图2d]。移植后四周，发现部分受体鼠胸腺中出现GFP标记的T淋巴细胞[图2c]。对GFP+胸腺细胞的流式细胞分析显示存在CD44+CD25-CD4-CD8- DN1、CD44+CD25+ DN2、CD44-CD25+ DN3和CD44-CD25- DN4的双阴性胸腺细胞（DN），CD4+CD8+双阳性胸腺细胞（DP），CD4+CD8-单阳性T淋巴细胞和CD8+CD4-单阳性T淋巴细胞（SP）[图2e]。
说明这候选的15种转录因子中，存在具有调控B细胞向T细胞转化作用的转录因子。可是这15种候选转录因子中的哪一种诱导B至T细胞转化呢？
Hoxb5的过表达将B细胞重编程为T细胞
为了找到15种候选转录因子中的哪一种诱导B至T细胞转化，研究人员进一步缩小筛选范围。将上述实验中得到得到GFP+胸腺细胞进行单细胞PCR测序，结果发现，这些胸腺细胞大致可以分为这三类病毒来源：1.表达Hoxb5的逆转录病毒（retro-Hoxb5）；2.表达14转录因子但缺乏Hoxb5（14-TF）；3. 只表达GFP的对照的病毒。结果显示，在所有retro-Hoxb5-pro-pre-B细胞受体小鼠（以下称retro-Hoxb5小鼠）中，超过65％的胸腺有核细胞是Ter119-Mac1-CD19-GFP+，而在14-TF或pro-pre-B细胞转移的小鼠中未检测到[图3a]。在移植后4周和8周时，能够在retro-Hoxb5小鼠外周血（PB），脾和淋巴结（LN）中检测到GFP+CD4+和GFP+CD8+成熟T细胞，随后在PB中12周降低和消失[图3b]。GFP+ T细胞包括TCRβ+和TCRγδ+细胞。
此外，研究者从15-TF小鼠中分选GFP+胸腺细胞进行单细胞测序,结果证明上述细胞在单细胞水平同时含有B细胞BCR的Ig重链V(D)J和T细胞TCRβ的V(D)J重组现象 [数据未展示] 。
这些数据表明，Hoxb5有可能是调控B细胞向T细胞转化过程中起关键作用的转录因子。那么我们如何进一步确定这样的结果呢？而且在上述的实验中，Hoxb5的组成型表达是否有影响到T、B细胞的发育呢？
为了排除这些影响，并验证上述实验结果。科研人员构建了一个关键的工具小鼠：Hoxb5LSL/+[图4a]。利用这个小鼠与特异性的Cre小鼠交配，得到两种组织特异性表达Hoxb5（并同时表达EGFP）的小鼠：1. Vav-Cre,Hoxb5LSL/+，造血细胞中特异性表达Hoxb5简称Vav-Hoxb5-GFP小鼠；2.CD19-Cre, Hoxb5LSL/+ ,B细胞中特异性表达Hoxb5简称CD19-Hoxb5-GFP小鼠。首先对这两种小鼠进行基本的流式分析检测，结果显示：1. CD19-Hoxb5-GFP小鼠显示出与来自同窝对照Hoxb5LSL/+相当的发育模式[图4b、c] ；2.与Hoxb5LSL+对照小鼠相比Vav-Hoxb5-GFP小鼠中所有造血细胞，包括T淋巴细胞，小鼠的骨髓和胸腺中的ETP（early T cell progenitors）比例相当 [图4f] 。胸腺中的DN和DP细胞[图4d] ，以及PB，脾，LN和BM中的CD4+和CD8+ T淋巴细胞的比例也相当 [图4e]。
这说明Hoxb5的组成型表达对B、T细胞发育影响都较小。
B细胞特异性表达Hoxb5可以将B细胞重编程为T细胞
对CD19-Hoxb5-GFP小鼠进行分析发现，外周血中约90％的CD19+ B淋巴细胞表达GFP-Hoxb5，而PB中的CD3+ T淋巴细胞或Mac1+骨髓细胞不表达GFP[图5a]。然而在小鼠4w、8w、12w的胸腺中却能检测到GFP+ T淋巴细胞 [图5b] 。
在将CD19-Hoxb5-GFP小鼠BM分离的pro-pre-B细胞移植到经辐照预处理的野生型同品系受体小鼠中。移植后4周胸腺中>30％的T淋巴细胞为GFP+[图5c]，脾脏中>10％的T淋巴细胞[图5d]和LN中的>7％[图5e]是GFP+。 这些结果表明Hoxb5特异性表达将B重编程为T细胞。
仿佛听到Hoxb5在说：你现在虽然是B淋巴细胞，但是只要同时表达了我Hoxb5，不久后你就会变成T细胞哦！厉不厉害？
