RNA实验方案和应用（二）
miRNA 模拟物是化学合成的，双链RNA分子（通常长度为18–24个核苷酸），通过转染到细胞中，模拟成熟的内源性miRNA分子。miRNA抑制剂是单链（通常长度为21–25个核苷酸），经过修饰的RNA分子，通过转染到细胞中，特异性的抑制miRNA的功能。模拟物和抑制剂包含一些化学修饰，以便提高活性或者增强其在体内的稳定性。
通过将miRNA模拟物转染到细胞中，并进行下游的基因表达分析或者表型分析，可以阐明特定miRNA分子的目标和发挥的作用。这些实验可以研究单个miRNA错误调节所造成的生物学影响，也能用于确定某个miRNA分子的特异性靶标基因。miRNA转染之后，如果降低或者提高基因的表达水平，说明研究的miRNA参与调节了这个基因的表达。类似的，miRNA在很多通路中的作用，都可以通过检测miRNA模拟物或者抑制剂转染之后的特定表型来研究。
miRNA模拟物/抑制剂转染对于下游应用的影响，通常可以通过如下方案来分析：
携带有报告基因，比如荧光素酶，和一个或者多个位于3’端非翻译区的miRNA结合位点的质粒载体做为miRNA的靶标。miRNA的模拟物/抑制剂与载体共转染到细胞中。在转染之后，进行报告基因检测实验，比如荧光素酶检测实验。通过将上述转染的结果与只转染质粒载体的结果比较，确定miRNA模拟物和抑制剂的影响。
将miRNA的模拟物/抑制剂转染到细胞中，然后检测相关的内源性基因（即所研究的miRNA分子的靶标）的表达。通过将结果与未转染的细胞或者转染了阴性对照的细胞的表达结果相比，可以确定miRNA模拟物/抑制剂的作用。由于miRNA通常抑制目标基因的翻译，而不降解目标基因的转录本，因此，一般通过检测蛋白的表达水平来确定基因的表达水平，比如通过蛋白质印迹法。这意味着miRNA模拟物/抑制剂的影响通常不能通过定量的real-time PCR 来检测。
| siRNA和RNAi |
siRNA 小干扰RNA（通常称做siRNA）参与多种生物学过程——最常见的是RNA干扰或者RNAi。 大多数RNA是单链的，但是，siRNA由两条互补的核酸链组成，与DNA类似。siRNA的长度大约为20–25个核苷酸。siRNA在RNAi过程中扮演了重要角色，它们通过互补的核苷酸序列来干扰特定基因的表达。 长度为21个核苷酸的双链siRNA分子的一些近似值：
RNAi RNA干扰（或者RNAi）是细胞中的一种自然发生的过程，它能够关闭或者沉默特定基因的活性。RNA干扰于1998年被发现，现在已经是研究基因功能的强大工具。 RNAi通过干扰信使RNA（mRNA）所携带的信息发挥作用，从而抑制蛋白的合成。mRNA失去活性，基因也就失活了。 诱导RNAi的双链RNA分子（siRNA），在进入细胞之后，被Dicer酶切割成小的片段。这些小的片段，作为引导物，引导siRNA与具有互补序列的mRNA相结合。然后，这些细胞内的mRNA被切割，从而有效地破坏了它们所携带的信息，并且沉默相应基因的表达。 RNAi的过程相当复杂。双链RNA被RNase III识别，然后切割成21–23个核苷酸大小的siRNA分子。这些siRNA分子参与组成了称做RISC（RNA-induced silencing complex，RNA 诱导的沉默复合物）的RNAi靶标复合物，这些复合物能够破坏与siRNA同源的mRNA分子。靶标mRNA分子在其与siRNA分子序列互补区域的中心处被切割，然后导致靶标mRNA分子被降解，降低了蛋白的表达。 使用siRNA siRNA分子是RNAi过程中的主要效应因子，可以通过化学方法或者酶催化的方法在体外合成。siRNA的序列设计对于有效的基因沉默是非常关键的，它们的设计方法是基于对RNAi过程的理解，以及对天然存在的siRNA分子的功能的理解，开发出来的。 siRNA的输送对于基因沉默实验是至关重要的。合成的siRNA分子可以通过电穿孔或者亲脂的试剂，输送到细胞内。但是，这两种方法都是暂时的。质粒系统能够用于表达短发卡RNA（shRNA）分子，它们是Dicer酶的底物，在体内能成熟成为siRNA分子。这样的系统能稳定地抑制目标基因的表达。也有一些病毒输送系统，能够将shRNA输送到难于转染的细胞系中。 RNAi实验原理及流程 |
