PRIMO使用技巧与应用细节问答（二）
注：以下FAQ内容来源于：
https://www.alveolelab.com/faq_topic/primo-micropatterning-cryoet/
可参考：https://www.alveolelab.com/applications/cryo-em-grid-micropatterning/
问1：使用PRIMO准备Cryo-ET（冷冻电镜）细胞样本有什么不同？
答：PRIMO无掩膜微图案系统（maskless micropatterning
system）可以用来控制细胞的粘附。因此，它能保证多个细胞精确地定位在电镜网格中（一般在网格的网眼正方形的中央）。而且，它能使您完全控制创建的微图案的设计。正如我们用户的研究论文所述，您可以控制细胞的形状、极性、伸展性，以便进行：
生物力学研究；
帮助进行FIB milling操作；
保证重复性和更有效的cryo-ET成像。
问2：PRIMO微图案法技术和所有电镜网格（EM grids）都兼容吗？
答：目前为止，我们检测了不同的网格材料，我们可以确定PRIMO微图案系统可以用于由碳膜、SiO2膜、硅氮化物膜（Silicon Nitride
film）组成的网格，可以包含或不包含网眼。作为一种无掩膜微图案法技术，它可以与所有经典的电镜网格兼容。如果您想查证它是否和您的网格模型兼容，可以联系我们。
问3：能否检测我使用的透射电镜网格（TEM grids）是否可使用PRIMO？
答：我们可以提供多种选择来检测PRIMO微图案系统。您可以联系我们来讨论您的cryo-ET实验，以便发现检测PRIMO的最好的解决办法。
问4：PRIMO系统可以透过膜进行微图案化（micropatterning）吗？
答：使用UV光穿透网格的膜进行微图案设计是可行的，因为膜是透明的。如果您想在网眼中进行图案设计，要确保放在电动载物台（the motorized stage of the setup）上的网格是上下颠倒的（需要设计的膜的一面朝向物镜一侧）。
问5：我怎么确定我设计的微图案处在电镜网格的网眼范围内？
答：Leonardo photopatterning
software可以自动检测电镜网格的网眼。然后可以将微图案定位于其中，并调整图案尺寸使其完美契合。当然，Leonardo
software也能进行预期结果的预览，因此您能在进行微图案化操作之前进行任何手动的修改。
问6：准备微图案化的电镜网格的过程需要多久？
答：每天您可生成5-15个微图案化的电镜网格，包括了从anti-fouling coating到protein incubation的所有步骤。
问7：操作电镜网格是一个精细的步骤，看上去这个过程增加了更多的操作步骤，有没有解决办法呢？
答：的确，微图案化的过程增加了更多的操作步骤，但是经过培训，您将学会如何进行微图案化操作而不会损坏电镜网格。进一步而言，我们能开发特定的PDMS
stencils（PDMS模板），可以将网格放置在盖玻片（或其他物品）上，并在整个操作流程中保持其位置不动，以减少对网格的操作。
问8：用PRIMO系统在电镜网格上得到的微图案的分辨率是多少？
答：用PRIMO无掩膜微图案系统在电镜网格中得到的微图案的分辨率是1.2µm，与在玻璃上得到的分辨率一致。
问9：能否在种植细胞之前保存已经进行微图案化的网格，能保存多久？
答：可以，在吸附蛋白之前，准备好的电镜网格可以在PBS溶液中保存一个月。
问10：PEG覆盖层的厚度是多少？
答：PEG覆盖层的厚度大概是5nm。
问11：在电镜网格微图案化之后，什么样的细胞可以种植上去？
答：与在玻璃上进行微图案化操作一样，经典的哺乳动物贴壁细胞可以种植在TEM网格的微图案上。目前为止，我们团队和用户已经成功操作的细胞包括：HeLa细胞、成纤维细胞（fibroblasts）、内皮细胞（epithelial
cells）、MDCKⅡ、PtK1。
问12：微图案化对细胞的状态和功能的影响如何？
答：通过控制细胞粘附，微图案化对它们的功能和行为有一定的影响。因为能建立更受控的、重现性更强的体外生化微环境，微图案法能在更加生理相关的条件下研究活细胞（Thery, Journal of Cell Science,2010）
问13：有没有利用你们的技术进行Cryo-ET研究的论文可供参考？
答：有的，您可以参考以下论文：
【1】M. Toro-Nahuelpan et.al., Tailoring cryo-electron microscopy grids by photo-micropatterning for in-cell structural studies, Nature Methods, 17, pp.50–54 (2020), https://doi.org/10.1038/s41592-019-0630-5 (Julia Mahamid's lab, EMBL)
【2】L. Engel et.al., Extracellular matrix micropatterning technology for whole cell cryogenic electron microscopy studies, Journal of Micromechanics and Microengineering, Volume 29, Number 11 (2019), https://doi.org/10.1088/1361-6439/ab419a (Beth Pruitt's lab, Stanford University, UC Santa Barbara)
【3】L. Engel et.al., Lattice micropatterning of electron microscopy grids for improved cellular cryo-electron tomography throughput, BioRxiv, posted Aug 31,2020, doi: https://doi.org/10.1101/2020.08.30.272237 (Alexander Dunn's lab, Stanford University)
PRIMO模组的FAQ
注：以下FAQ内容来源于：
https://www.alveolelab.com/faq_topic/the-primo-module/
问1：PRIMO模块里面内置的是什么类型的激光？
答：PRIMO模块里包括的是375nm的紫外激光器（UV laser）。
问2：激光的功率是多少？
答：从管状透镜（tube lens）射出的激光的功率是6mW-8mW。在物镜出口，激光的功率不同，取决于物镜的选择。当使用Nikon S Plan Fluor ELWD 20x/0.45参考物镜时，激光的功率是：5mW-6mW，光强大概是29mW/mm2。
问3：PRIMO模块的尺寸和重量是多少？
答：PRIMO模块的尺寸是：46.2 x 32.5 x 7.2cm（长x宽x高）。它的重量是15kg，由安装时提供的支架支撑。
专用的Leonardo软件的FAQ
注：以下FAQ内容来源于：
https://www.alveolelab.com/faq_topic/the-dedicated-leonardo-software/
问1：Leonardo软件的特征是什么？
答：（1）相同的图像的复制（设置排或列，调整间距）；
（2）重新排列连续的图案，或将图案排列在微结构上（预览、旋转）；
（3）图像梯度的管理。
问2：图像是如何画上去的？
答：我们推荐用Inkscape软件绘制图像（开源的矢量设计软件，类似Adobe Illustrator），可以在此获得“使用指导”（user
guide）。这个软件可以创造像素大小的，或毫米大小的图案，并按照Leonardo软件可识别的不同的文件类型进行保存。
问3：可以使用什么类型的图像文件？
答：要生成蛋白图案的图像文件格式必须是：tif格式（像素）或pdf格式（公制尺码）。
光照图案化平台和试剂的FAQ
注：以下FAQ内容来源于：
https://www.alveolelab.com/faq_topic/photopatterning-platform-and-reagents/
问1：什么样的设备能安装使用PRIMO模组？
答：（1）安装有对焦维持系统（focus maintaining system）的倒置显微镜【1】：
Nikon Ti-E 和 Ti-2
Leica DMi8
Olympus IX83
（2）有落射荧光系统（Epifluorescence system）；
（3）有电动X/Y载物台；
（4）有照相机；
（5）有计算机；
（6）有等离子体反应器（又称电浆机）（plasma reactor）和专用的泵(dedicated pump)【2】。
【1】按需可提供完整的显微镜配置；
【2】可根据实验条件进行选择。
问2：用PRIMO进行蛋白光图案化时需要用到哪些耗材和试剂？
答：用到的耗材和试剂包括：
（1）PLPP溶液 1x；
（2）用玻璃或塑料制作的标准细胞培养基质（载玻片、盖玻片、培养皿、3D设备，等），或预先用抗污聚合物处理过的基质；
（3）预先切割好的PDMS stencils（PDMS模板）（自由设计）【3】；
（4）石蜡封口膜（parafilm）；
（5）尖头镊子；
（6）微量移液器和适合的枪头；
（7）在10mM HEPES pH=7.4中配置的PLL-PEG 1x溶液【4】；
（8）待粘附的蛋白的溶液，C=10-100µg/mL；
（9）PBS 1x溶液，pH=7.4。
【3】可选项；
【4】推荐在没有预处理的基质上进行抗污表面处理。
