2020版药典解读四-生物毒素类污染残留的操作与变化-2
【附注】
1. 本实验应有相应的安全、防护措施，并不得污染环境。
2. 残留有黄曲霉毒素的废液或废渣的玻璃器皿，应置于专用贮存容器（装有10%次氯酸钠溶液）内，浸泡24小时以上，再用清水将玻璃器皿冲洗干净。
二、2020版药典相比2015版药典检测黄曲霉方法变化解读
三、SN/T 4604-2016 进出口中药材中真菌毒素的测定（节选）
1. 范围
本标准规定了进出口中药材中黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2、M1、M2，赭曲霉素A，伏马毒素B1、B2，T-2毒素，HT-2毒素，二羟基苯甲酸内脂类真菌毒素的液相色谱-质谱/质谱检测方法。
本标准适用于进出口当归、桔梗五味子、枸杞、大青叶、金银花、地龙中黄曲霉素B1、B2、G1、G2、M1、M2，赭曲霉素A，伏马毒素B1、B2，T-2毒素，HT-2毒素，二羟基苯甲酸内脂类真菌毒素的液相色谱-质谱/质谱检测方法。
2. 分析步骤
(1) 提取
称取5g试样(精确到0.01g)置于50
mL具塞塑料离心管中，加人1g氧化钠，再加人PBS溶液25 mL，均质提取2 min，5000 r/min离心10
min，将全部上清液用玻璃纤维滤纸过滤后得提取液A；向残渣中加人25 mL甲醇，均质提取2 min，5000 r/min离心10
min，取上清液10 mL，用PBS稀释至100 mL，用玻璃纤维滤纸过滤后得到提取液B。
(2) 免疫亲和柱净化
称取5g试样(精确到0.01g)置于50
mL具塞塑料离心管中，加人1g氧化钠，再加人PBS溶液25 mL，均质提取2 min，5 000 r/min离心10
min，将全部上清液用玻璃纤维滤纸过滤后得提取液A；向残渣中加人25 mL甲醇，均质提取2 min，5000 r/min离心10
min，取上清液10 mL，用PBS稀释至100 mL，用玻璃纤维滤纸过滤后得到提取液B。
将免疫亲和柱连接于10 mL玻璃针筒下,将50 mL提取液B全部通过免疫亲和柱(PriboFast®复合免疫亲和柱)(流速控制在1滴/s~2滴/s)然后用10
mL含0.1%吐温的PBS淋洗亲和柱，再将5mL提取液A通过免疫亲和柱（流速控制在1~2滴/S）。待提取液全部通过亲和柱，用5mL含0.1%吐温的PBS和20mL水淋洗亲和柱，直至空气进入亲和柱，弃去全部流出液；用2
mL甲醇淋洗亲和柱(流速控制在1滴/S)，当甲醇大部分过柱时，停止加压，静置孵育5 min，再用2
mL甲醇淋洗亲和柱(流速控制在1滴/S)，收集全部淋洗液；将淋洗液置于40℃下水浴氮气吹干，用1 mL甲醇-2
mmol/L乙酸铵溶液(含0.1%甲酸)(40：60体积比)溶解残渣，过0.22 μm有机系滤膜，用液相色谱-质谱/质谱测定。
四、复杂中药材样品测定解决方案
针对目前药典方法检测中药材中黄曲霉毒素过程中出现的决明子、远志、槟郎等个别样品基质复杂，净化效果差，谱图中杂质峰过多的问题，普瑞邦技术中心制定了一套针对中药材前处理的解决方案。应用此解决方案进行样品前处理，经高效液相色谱柱后光化学衍生进行检测可达到较好的净化效果，杂峰明显减少，使分析结果更加准确。供广大同行老师参考：
图1 方法优化后（左）与优化前（右）远志样品过柱对比
图2 方法优化后远志样品加标与标准品叠加对比
图3 方法优化前远志样品加标与标准品叠加对比
五、Auto IPS-6060 全自动免疫亲和操作仪应用于药典中黄曲霉毒素测定
通过Auto IPS-6060 全自动免疫亲和操作仪在2015版药典中检测黄曲霉的案例，对比手工的精密度和回收率。全自动免疫亲和操作仪不但在具体的方法操作和技术运用上更加先进，而且在整个分析过程中都有非常严格的质量控制和质量保证，确保分析结果准确，排除人为操作造成的实验误差。
黄曲霉毒素B、G混标
表1：精密度与回收率比对表
| 序号 | 手动 | IPS | ||||
| 结果μg/kg | 回收率% | 精密度% | 结果μg/kg | 回收率% | 精密度% | |
| 1（远志样品） | ND | —— | —— | ND | —— | —— |
| 2（远志加标） | 7.03 | 70.3 | 11.1 | 7.74 | 77.4 | 5.7 |
| 3（远志加标） | 8.71 | 87.1 | 8.66 | 86.6 | ||
| 4（远志加标） | 7.53 | 75.3 | 8.05 | 80.5 |
*注：上表采用远志样品，按照10μg/kg进行添加。
表2：成本及操作比对表
| 对比 | 时间成本 | 操作 |
| 手动 | 2h | 复杂 |
| IPS | 1h | 简单 |
| IPS优势 | 节省1h | 简单、一致性好 |
*注：上表按照4支柱子进行对比。
Auto IPS-6060 全自动免疫亲和操作仪在进行过免疫亲和柱实验中得到了优于手动过柱的结果，通过比对不难发现，Auto IPS-6060
全自动免疫亲和操作仪在回收率和精密度方面有所提高，大大节省了人力以及时间成本，同时也缩短了实验人员接触试剂的时间，最大程度地保证了实验人员的安全。
六、中药材黄曲霉毒素测定采购指南
| 产品描述 | 规格 | 货号 | 备注 |
| KRC光化学衍生器 | KRC-15 | KRC10230 | Pribolab |
| 254nm低压紫外灯光源+15米反应池 | 8W | —— | 标配 |
| MDU 光化学衍生器 | MDU-I | MDU20230 | Pribolab |
| 低压紫外灯光源+全透明质化反应池 | 9W | —— | 标配 |
| 液相色谱柱 MycoChrm C18 | 5μm4.6*150 | 185150 | AFT专用 |
| 不锈钢高速均质器 | 1.1L | EQ-800S | >20000r/min |
| 中药材专用黄曲霉毒素 免疫亲和柱（1mL） |
25T | IAC-011-1 | —— |
| 中药材专用黄曲霉毒素 免疫亲和柱（3mL） |
25T | IAC-011-3 | —— |
| 多毒素复合免疫亲和柱 | 15T | IAC-400-6 | 出入境标准 |
| 中药专用缓冲液 | 份 | —— | 标配 |
| 固定/旋转泵流操作架 | 8/12位 | EQ-RACK 8/12 | —— |
| 玻璃纤维滤纸 | 100P | GF/A-110 | 110mm 1.5μm |
| PEEK两通 | 2P | SP0802 | —— |
| 黄曲霉毒素总量混合标准品 (AFB1,G11.0µg/mL;AFB2,G20.3µg/mL) |
1mL | STD#1082 | —— |
| 收集瓶 | —— | 20个 | —— |
*备注包括1年免费保修和终身维护(反应池和纳米灯管除外).
七、中药材黄曲霉毒素测定常见问题举例
1. 样品中目标峰保留时间发生偏移
2. 部分中药材前处理不干净，液相杂峰多
3. 样品中峰的定性判断
4. 远志、槟郎等过柱困难的样品处理
5. 液相色谱峰拖尾或前沿
6. 色谱柱如何维护
7. 标准品的保存与分解
8. 样品加标回收的方法
9. 曲线线性不好
10. 基线不平，噪音大
注：如有问题请与我们联系！
此文件仅供参考，具体内容以2020版药典为准。
本文件中的信息，如有改变，恕不另行通知。
