如何冻存细胞
一、材料
（一）仪器
1.
净化工作台
2.
离心机
3.
恒温水浴箱
4.
冰箱（4℃、-20℃、-70℃）
5.
倒置相差显微镜
6.
培养箱
7.
液氮冰箱
（二）玻璃器皿
1.
吸管（弯头、直头）
2.
培养瓶
3.
玻璃瓶（250ml、100ml）
4.
废液缸
（三）塑料器皿
1.
吸头
2.
枪头
3.
胶塞
4.
移液管（10ml）
5.
15ml离心管
6.
冻存管（1～2ml）
（四）其他物品
1.
微量加样枪
2.
红血球计数板
3.
记号笔
4.
医用橡皮膏
5.
移液枪
（五）试剂
1.
D-Hanks液
2.
小牛血清
3.
培养液
4.
双抗（青霉素、链霉素）
5.
胰蛋白酶（0.08%）
6.
1NHCl
7.
7.4%NaHCO3
8.
DMSO（分析纯）或无色新鲜甘油
二、操作步骤
（一）细胞冻存
1.
配制含10%DMSO或甘油、10～20%小牛血清的冻存培养液；
2.
取对数生长期的细胞，用胰蛋白酶把单层生长的细胞消化下来，悬浮生长的细胞则直接将细胞移至15ml离心管中、；
3.
离心1000rpm，5min；
4.
去除胰蛋白酶及旧的培养液，加入适量配制好的冻存培养液，用吸管轻轻吹打使细胞均匀，计数，调节冻存液中细胞的最终密度为5×106/ml～1×107/ml；
5.
将细胞分装入冻存管中，每管1～1.5
ml；
6.
在冻存管上标明细胞的名称，冻存时间及操作者；
7.
冻存：标准的冻存程序为降温速率-1～-2℃/
min；当温度达-25℃以下时，可增至-5℃～-10℃/
min；到-100℃时，则可迅速浸入液氮中。也可将装有细胞的冻存管放入-20℃冰箱2h
，然后放入-70℃冰箱中过夜，取出冻存管，移入液氮容器内。
（二）
细胞复苏
1.
从液氮容器中取出冻存管，直接浸入37℃温水中，并不时摇动令其尽快融化。
2.
从37℃水浴中取出冻存管，打开盖子，用吸管吸出细胞悬液，加到离心管并滴加10倍以上培养液，混匀；
3.
离心，
1000rpm，5min；
4.
弃去上清液，加入含10%小牛血清培养液重悬细胞，计数，调整细胞密度，接种培养瓶，37℃培养箱静置培养；
5.
次日更换一次培养液，继续培养。
三、注意事项
1．从增殖期到形成致密的单层细胞以前的培养细胞都可以用于冻存，但最好为对数生长期细胞。在冻存前一天最好换一次培养液；
2．将冻存管放入液氮容器或从中取出时，要做好防护工作，以免冻伤；
3．冻存和复苏最好用新配制的培养液。
