P57 （KIP2）控制肌动蛋白细胞骨架动力学对线粒体促凋亡
实验概要
P57（KIP2细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂1C），经常发现于下调癌症的发生，据报道，有抑癌的特性。作为一个周期蛋白依赖性激酶（CDK）抑制剂P57KIP2阐述了对细胞周期的调控，包括细胞死亡和细胞迁移。细胞迁移抑制P57KIP2通过激活LIM结构域激酶1（LIMK-1）稳定肌动蛋白细胞骨架。P57KIP2能够促进线粒体介导的细胞凋亡，P57KIP2的表达能增加细胞的死亡。本试验检测P57KIP2蛋白的表达，从而分析它对细胞凋亡的影响。
主要试剂
质粒和siRNA
含Myc-LIMK-1和Myc-LIMK-1 D640的AFPC1载体（Tohoku University，Japan）
肌动蛋白GFP质粒（University of Helsinki，Finland）
GFP的质粒（Invitrogen公司，Carlsbad，CA，USA）
实验步骤
1. 培养细胞的转染
在四环素启动子的作用下，人宫颈癌HeLa细胞能够表达P57 KIP2（来源Okret, Karolinska Institutet）。将细胞培养在MEM培养基（Gibco公司，Carlsbad, CA, USA），含10 ％的胎牛血清，青霉素和链霉素，非必需氨基酸，丙酮酸钠，L-谷氨酰胺。添加2μg/m到培养基Dox，24h后诱导P57 KIP2的表达。根据试剂盒指示转染细胞。
2. 提取蛋白，免疫印迹
收获细胞，在含有蛋白酶抑制剂的NP40裂解缓冲液中超声破碎。将蛋白裂解物在Laemmli缓冲液中加热到95℃，5分钟。加入20-40 μg蛋白在12％的SDS-PAGE丙烯酰胺凝胶进行电泳，然后在硝酸纤维素膜上进行免疫印迹。将膜放在5％的脱脂牛奶中封闭，加入抗-PARP（BD Pharmingen, Franklin Lakes, NJ, USA），抗- P57 KIP2培养KIP2（C-20, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA)），和抗-GFP（Santa Cruz Biotechnology），抗外膜移位40（(tom40; Santa Cruz Biotechnology)），或抗甘油三磷酸脱氢酶（G3PDH; Trevigen, Gaithersburg, MD, USA）在4 ℃孵育过夜，加入辣根过氧化物酶二抗（1：10000）室温下孵育1h。增强化学发光剂可见条带（Pierce，Rockford，IL, USA）。
3. 荧光光漂白后恢复（FRAP）
FRAP用来评估移动的绿色荧光肌动蛋白单体。HeLa- p57KIP2细胞平铺于盖玻片，用绿色荧光肌动蛋白转染HeLa- p57KIP2细胞。然后将盖玻片放置在POC-chamber/CTI Controller/heating insert P system检测活细胞。经过用100％氩/2激光488 nm的光强度（电流4.7 安培）漂白，荧光漂白的恢复时间是20 毫秒间隔监测。在Axiovert 200m显微镜（Zeiss, Oberkochen, Germany）下分析样本。
4. caspase-3/ 7活力的检测（DEVDase）
通过测量DEVD-MCA荧光底物的分裂率来计算细胞裂解后DEVDase的活力（Peptide Institute Inc., Osaka, Japan）。解离的AMC通过FluoroscanII板(Labsystems, Waltham, MA, USA) 在355 nm吸收和460 nm发射波长读数检测。
5. 线粒体跨膜电位的测量
细胞培养于25 nM四甲基罗丹明乙酯（TMRE）（分子探针，Carlsbad, CA, USA），37°C，30分钟 然后收集细胞。用PBS洗涤细胞两次，胰酶消化，重悬于PBS中，流式细胞仪读数，分析结果。
6. 细胞分离
收集细胞，用PBS洗两次，用缓冲液A重悬浮，放置冰上10分钟（ 10 mM HEPES，pH7.9，4 °C，1.5 mM MgCl2, 10 mM KCl 和 0.5 mM DTT）。细胞4 °C离心2000转\5 分钟。细胞沉淀悬浮于含有0.2％ NP40和蛋白酶抑制剂的缓冲液A中，放置冰上2分钟。离心 500转\2分钟，收集上清，进一步离心14 000/ 30 分钟。上清和沉淀中分别为胞质和线粒体。
7. 凋亡核形态定量分析
生长在盖玻片上的细胞，被处理，在4 °C 用4的％多聚甲醛固定细胞15 分钟。然后滴加Hoechst染液（1 μg/ml），在室温下染色10 分钟，每个样品计数至少有200个细胞。
8. F-肌动蛋白的检测
检测F-肌动蛋白，生长在盖玻片上的细胞被固定并于室温下孵育于rhodamine-conjugated phalloidin （1 ： 8000）30 分钟。细胞核被染色染色通过滴加Hoechst染液（1 μg/ml），室温下作用10分钟。通过510共聚焦显微镜观察细胞细胞。
9. 测量的分裂的 caspase-3
37°C下用4％多聚甲醛固定细胞10 分钟，在-20 °C用90％甲醇作用30分钟。细胞孵育于封闭液（含0.5％ BSA的PBS）10 分钟，然后加入抗分裂的caspase-3（细胞信号转导，丹弗斯，马萨诸塞州，美国; 封闭液稀释1：3200，室温 ） 作用1小时，然后加入羊抗兔Alexa 488（Invitrogen公司; 封闭液稀释1 ：200 ）作用30分钟。每次加完抗体用封闭液洗一次细胞，最后悬浮于PBS中经流式细胞仪检测分析。
10. 统计分析
使用双尾，配对t -检验进行统计分析， P <0.05， P <0.01为差异显著性水平。
