电泳及转膜技术
实验概要
掌握 Southern blotting 的原理及操作步骤
实验原理
1．转膜的方式：
向上的毛细管转移
向下的毛细管转移
同时向两张膜转移
电转移
真空转移
2．固相支持物的种类及选择：
硝酸纤维素膜：非共价结合，易脆，易丢失 DNA ， < 500 bp 的 DNA 无效，转膜前的工作（从提高转膜效率，利于转膜后使用等）
尼龙膜（带正电荷的）高强度，不易破损，具有较大的 DNA 结合容量，它能够吸附变性 DNA ，核酸以共价结合方式不可逆的结合在尼龙膜上。尼龙膜两边均有吸附 DNA 的功能，无论用哪边均可以经久耐用，可反复利用 10 次以上（ 10-20 次），经毛细管（毛细吸附）作用，把 DNA 从凝胶上转到膜上。 DNA 转到膜上是复制胶上的带型，在 80-100 ℃真空干燥 2-4 hrs ，即可固定 DNA 。
3．转移缓冲液（ transfer buffer ）的选择：
带正电荷的尼龙膜：可用高盐离子强度（ SSC ），但不能充分发挥膜潜能； 0.4N NaOH ，共价结合 DNA 是最大优点。
硝酸纤维膜：高盐离子强度促进 DNA 与膜结合（ 20 × SSC ），低盐离子强度导致小片段 DNA 在转移过程中丢失， pH>9 ， DNA 不能与膜结合。
4．转膜时间（ duration of transfer ）约 12 hrs
取决于毛细管系统， DNA 大小，胶厚度 (<5 mm) 及浓度 (<1%) 。
DNA 分子量大小决定时间长短，部分去嘌呤减小 DNA ，碱转移 2hrs 大部分结合到膜。
DNA 转移的效率较难判断，只有在转膜结束后，通过 EB 染胶，及分子杂交才可以鉴别效率高低，但已无补救措施，因此，每一步应严格操作。
主要试剂
0.4N NaOH
0.2NHCl
琼脂糖
主要设备
尼龙膜
滤纸
玻板
电泳槽
实验材料
酶消化好的 DNA 样品
实验步骤
1．0.8% 琼脂糖电泳
制胶：注意琼脂糖的质量，胶的浓度，厚度（<5mm）及均一性。一般大电泳槽配制 250ml 0.8% 琼脂糖凝胶，采用 42 孔梳子（经济，高效）
制样，点样： DNA 样品中指示剂量稍多
电泳：一般 1-1.5V/cm 的电压，使 DNA 迁移到适当距离，一般指示剂约移动 10-11cm ( 大电泳槽： 40V × 12-15hrs ，小电泳槽 30V × 4-5 hrs)
2．转膜前的准备：
依胶大小每块凝胶准备两张比胶稍大的滤纸（ 11 × 12.5 cm ），两张用作盐桥的滤纸，一张与胶同样大小的尼龙膜（ 10 × 10.5cm ），两个玻璃盘、两块有机玻璃板、一根玻璃棒，比尼龙膜稍大的一叠吸水纸等。
3．一玻璃盘中加入足量的 0.4N NaOH ，放上洗净的玻璃板，按图示搭制盐桥 ( 操作示范 ) 。
4．凝胶的预处理：
a.从电泳槽中移出凝胶置于塑料板上，用切胶板把胶切成适当大小，切去右上角（最后一个样品的最前端）作为电泳方向记号
b.把凝胶翻面，放入加有足量 0.2N HCl 的玻璃盘中，轻轻摇动 10min ，使指示剂变黄色为止（脱嘌呤）
c.倒去 HCl 溶液，加蒸馏水漂洗凝胶
d.倒去蒸馏水，加 0.4N NaOH 中和
e.同时在盐桥滤纸上洒些 0.4N NaOH ，立即将胶放在盐桥上（忌气泡）
5．胶的四周用塑料片与胶紧紧相连，防止短路（吸水纸与盐桥相接）
6．在胶面上倒足够量 0.4N NaOH ，小心放置膜（预湿 0.4N NaOH ）使膜覆盖整块胶（要求一次成功，不能移动）
7．膜上放 2 张滤纸，滤纸大小为 15 × 12cm
8．放不少于 5cm 厚的吸水纸，放上玻板，其上压约 500g 的重物，转膜 12 hrs 左右
9．转膜完毕，用 2 × SSC 漂洗膜两次，各 5min 。用 EB 染胶以检测转移效果。
10．用两张滤纸包住膜，置于 80-100 ℃的真空干燥箱中，干燥 2-4 hrs 。
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焦点事件
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