正常小鼠腹股沟脂肪垫获取脂肪源干细胞
正常小鼠腹股沟脂肪垫获取脂肪源干细胞
实验材料：
1.Hank&rsquo缓冲盐溶液（H）；
2.ASC培养基：含10%胎牛血清的DMEM，添加1%的P/S；
3.胶原酶溶液：100ml Hank&rsquo缓冲盐溶液中加入1g牛血清白蛋白和0.1gⅡ型胶原酶；
4.聚乙烯吡咯酮碘溶液；
5.陪替氏培养皿，9cm；离心管，50ml；组织培养瓶，25cm2；
6.剪刀（2把），镊子（2把）；
7.A；
8.小鼠，4—6只；
9.麻醉剂：三溴乙醇；
实验方法：
1.37℃水浴中预热H和脂肪源干细胞培养基；
2.麻醉动物后处死；
3.转移动物至层流净化罩中；
4.70%酒精消毒腹部；
5.采用低位横向切口打开腹腔；
6.用镊子取出性腺/附睾和腹股沟处的脂肪垫；
7.将脂肪组织置于培养皿中，加入H；
8.待所有动物脂肪取出后，将脂肪转移至新的培养皿中；
9.加入含有5%聚乙烯吡咯烷碘酮的H 2—3min；
10.漂洗组织并用H洗涤脂肪；
11.用无菌镊子将脂肪转移至50ml离心管中；
12.用无菌剪刀将脂肪切碎；
13.加入与组织体积相同的胶原酶溶液并混匀；
14.将离心管置于37℃水浴中60min，其间不时混匀一下；
15.离心，50—100g，5min；
16.取出离心管，用力摇晃（将基质细胞与原代脂肪细胞完全分离），再次离心5min；
17.小心吸去上层油脂，油脂层中含有原代脂肪细胞，注意不要破坏位于下方的基质—血管细胞层；
18.加入5—10ml A，重悬沉淀，再次离心5min；
19.洗涤三次，注意不要吸走基质—血管细胞层；
20.最后一次洗涤后，加入8ml ASC培养基重悬沉淀，转移至T25培养瓶中，置于37℃，5%CO2温箱中；
21.待细胞贴壁生长2—4天后换液；
22.换液时通过弃去培养基，从而去除未贴壁的细胞；
23.以后每周更换培养基2次。
