系统化生物芯片技术在功能基因组研究中的应用简介
三、生物芯片技术研究应用点滴
人类基因组计划推动了各种生物基因组测序工作的进展，越来越多的生物全基因组序列被测定并公布，可是这才是解读“天书”的开始。掌握了基因组序列，却不知道基因序列背后所隐藏的秘密——即基因组的功能，就不能真正理解“天书”更谈不上服务于人类。如何从海量的基因序列数据中发掘这些成千上万基因的功能，研究基因在生命过程中所担负的重要角色，成为基因组时代特别是后基因组时代面临的重要课题，亦即功能基因组研究[6]。在这样的背景下，生物芯片技术于20世纪90年代产生并迅速发展为席卷生物、生命科学、医学等等研究、应用领域的一个热点技术，对传统生物分析方法起到了非常大的推动和变革作用。
1、FDA批准上市荷兰Agendia公司的MammaPrint基因表达谱芯片
传统生物分析实验方法研究基因组功能的最大缺点是：孤立、片面研究单独或少数基因在生命过程、疾病发生中的作用，忽视了基因间的相互影响和协同作用。这也是受传统实验方法本身特点所限，因为这些实验往往步骤繁琐而且一次只能完成少数分析。生物芯片技术具有高通量的特点，在一次芯片分析结果上就可能显示出成百上千的基因的信息，而综合、系统地考虑众多数目的基因的变化是成功揭示基因组功能的关键。
2007年2月，美国食品药物管理局（FDA）批准了荷兰Agendia公司的MammaPrint基因表达谱芯片。这是世界上首个被FDA批准上市的基因表达谱分子诊断芯片产品[7]。MammanPrint基因表达谱芯片是一种用于乳腺癌预后诊断的芯片产品，可以预测患者在首次发生癌症的5到10年内乳腺癌复发的可能性[7]。一般乳腺癌通过手术切除治疗后，对于预后效果好坏，是否需要进行化疗或者使用哪种药物治疗等问题，通常只能依靠医生参考一些指标作出经验判断，人为因素影响大。该基因表达谱芯片通过综合分析病人的70个基因表达，能够比较准确地预测病人的预后效果，以便医生决定采取有针对性的治疗方案[7]。
2、生物芯片用于比较基因组杂交（CGH）研究
比较基因组杂交（comparative genomic hybridization，CGH）芯片通过检测、比较样品与对照样品的基因组DNA的拷贝数量，可以直观地得到基因组DNA发生变异的位点信息及拷贝数量变化信息。1998年，Pinkel等利用比较基因组杂交（CGH）微阵列芯片技术实现了基因组DNA拷贝数量变化的高灵敏度分析[8]。该工作发表在当年10月份的Nature Genetics上。基因组DNA片段的扩增或缺失在许多疾病的发生、发展过程中起到重要作用，例如，抑癌基因及原癌基因的缺失或过度表达引起了癌症的发生[8]；另外，同一物种的不同亚型含有不同的基因表型。因此，比较基因组杂交芯片可以用于肿瘤等疾病的诊断，肿瘤遗传学研究，以及对同一物种的不同亚型进行准确分型等等。比较基因组杂交芯片的检测过程主要如下：将样品及参照样品基因组DNA进行处理，并标记上不同的荧光基团，混合均匀后与微阵列芯片上DNA探针进行杂交。基因组DNA拷贝数量即与杂交后芯片上样品与参照样品荧光强度比值有关，如果样品的基因组DNA某序列下调，则该序列位置处样品荧光要弱于参照样品的荧光，反之则强于后者[8,9]。
3、生物芯片用于单核苷酸多态性（SNP）研究
人类基因组携带了重要的遗传信息。基因组DNA中单个碱基的置换、缺失或插入是非常普遍的DNA多态现象，人类基因组序列在不同人种、人群和个体之间存在大约0.1%-0.2%的DNA序列差异，即单核苷多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）[10]。2005年，Altshuler等在Nature上发表了题为“人类基因组单体型图”的工作（A haplotype map of human genome）[11]。在来自不同人群的269个DNA样本中，研究者发现至少存在100万种单核苷多态性（SNP）改变，并找到了人类基因组中很多热点区（hotspot，即最易出现SNP的位置）。在热点区基因组容易改变从而发生不同的演化，使人类逐渐进化，或者形成疾病及对疾病的易感性[11]。人类基因组单体型图，特别是热点区的单体型图旨在揭示比较不同个体的单核苷多态性（SNP）分布，以了解个体差异的分子机制。由单核苷多态性（SNP）所引起的遗传多态性与个体惟患疾病种类、程度及个体药物代谢差异都有非常密切的关系。所以，检测单核苷多态性，并且深入了解单核苷多态性等基因变异与疾病发生、发展，个体药物代谢的关系，对于疾病的预测、预防、诊断，有针对性地使用特效药物，合理设计治疗策略以及预后治疗等都有着重要意义[10,12]。用于单核苷多态性检测的基因芯片可根据需要，固定覆盖全基因组50万个SNP的探针，将样品基因组DNA酶切、扩增后进行荧光标记，并与芯片上的探针杂交，分析结果就可以得到单核苷多态性的分布及表达量[13]。
4、利用生物芯片测定MicroRNA实现精确的肿瘤分子分型
microRNA (miRNA)是一类长度很短的非编码调控单链小分子RNA。它由基因组DNA编码、通常长度约20～24个核苷。microRNA是由一段具有发夹环结构，长度为70～80个核苷的单链RNA前体（pre－miRNA）剪切后生成[14]。研究发现，microRNA与siRNA有相似之处，但也有很大不同。siRNA即小干扰RNA（small interfering RNAs）可以诱导与siRNA单链序列完全互补结合的靶mRNA被酶降解，从而抑制该基因的表达，即基因沉默[15]。siRNA是人工合成，外源性的能够沉默特定基因的小分子RNA。而microRNA是哺乳动物细胞内广泛存在的，能够调节许多基因表达的小分子RNA[14]。microRNA主要通过降解mRNA和抑制翻译两种方式调控生物体内的基因表达，在动植物的生长发育、细胞的分化和凋亡以及人类疾病的发生（如肿瘤）等过程中发挥着重要的调控作用[14，16]。2005年，Lu等在Nature上发表题为“microRNA表达谱用于癌症分类”(MicroRNA expression profiles classify human cancers)的报道[17]。研究人员系统分析了217个哺乳动物的microRNA，发现肿瘤细胞中各种microRNA的拷贝量与正常细胞相比普遍下调。利用microRNA表达谱，他们成功地对难以区分的肿瘤进行了准确分类，而利用mRNA表达谱则无法实现分类[17]。最近，Zhang等发表了题为“microRNA在肿瘤发生过程中作用”（MicroRNAs in Tumorigenesis：A Primer）的综述[18]。文中指出microRNA的特殊功能与肿瘤发病机理密切相关，使其在肿瘤的分类和预测方面都具有重要价值。所以通过测定microRNA可以实现精确的肿瘤分子分型，以便掌握肿瘤个体差异,准确有效地用药。由于动植物细胞内microRNA序列众多，例如已知的人的成熟microRNA有近600个之多，小鼠、大鼠的成熟microRNA分别为350多个及230多个[16]。所以要系统考查如此数目众多的microRNA的表达情况,必须借助高通量的实验手段，基因芯片技术就是非常适合的方法。首先根据已知的microRNA序列设计制备合适的microRNA芯片，一般是含有几百个RNA探针的阵列。分离样品的低分子量RNA进行荧光素标记，然后和芯片上的探针杂交，获取荧光信号，分析结果得到microRNA表达信息[16]。
结语
生物芯片技术的出现给传统生物分析研究带来了巨大变革。经典分子生物学往往研究个别基因的作用。随着人类基因组计划的完成，庞大的基因组DNA序列被揭示，但是基因组相关的很多功能仍是未解之迷。要从海量的基因序列数据中发掘这些成千上万基因的功能，研究基因在生命过程中所担负的重要角色——亦即功能基因组研究，依靠经典分子生物学等传统的生物分析方法已经远远不能满足要求。生物芯片技术具有高通量的特点，对于需要同时、系统分析很多基因的功能基因组的研究是非常有力的工具。
参考文献
[1]http://money.cnn.com/magazines/fortune/fortune_archive/1997/03/31/224035/index.htm
[2]http://most.gov.cn/ztzl/jqzzcx/zzcxcxzzo/zzcxcxcg/zzcxgncxcg/200505/t20050513_21537.htm
[3] http://www.istis.sh.cn/hykjqb/wenzhang/list_n.asp?id=1634&sid=2
[4] http://www.fda.gov/nctr/science/centers/toxicoinformatics/maqc/
[5] MAQC Consortium，The MicroArray Quality Control （MAQC）project shows inter-and intraplatform reproducibility of gene expression measurments，Nature Biotechnology，2006，24, 1151－1161
[6] 陈竺，李伟，俞曼，熊慧，陈赛娟，人类基因组计划的机遇和挑战：1从结构基因组学到功能基因组学，《生命的化学》1998年18卷5期，5－13页
[7] http://www.fda.gov/bbs/topics/NEWS/2007/NEW01555.html
[8] Pinkel D et al, High resolution analysis of DNA copy number variation using comparative genomic hybridization to microarrays，Nature Genetics，1998，20，207-211
[9] http://www.capitalbio.com/Exhibit/exhview1.asp?pid=223
[10] http://genetics.gsk.com/link.htm
[11] Altshuler D, Brooks LD, Chakravarti A, Collins FS, Daly MJ, Donnelly P, A haplotype map of the human genome，Nature，2005，437，1299－1320
[12] http://genetics.gsk.com/determin.htm#SNPs
[13] http://www.capitalbio.com/Exhibit/exhview1.asp?pid=222
[14] 华友佳，肖华胜，microRNA研究进展，《生命科学》2005年17卷3期，278－281页
[15] http://www.bioon.com/experiment/rna6/62935.shtml
[16] http://www.capitalbio.com/Exhibit/exhview1.asp?pid=242
[17] Lu J et al，MicroRNA expression profiles classify human cancers，Nature，2005，435，834－838
[18] Zhang WY，Dahlberg JE，Tam W，MicroRNAs in Tumorigenesis：A Primer，American Journal of Pathology，2007，171，728－738
