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层析技术(Layer-analise technique)(1)

2020.9.07

离子交换层析技术是以离子交换纤维素或以离子交换葡聚糖凝胶为固定相，以蛋白质等样品为移动相，分离和提纯蛋白质、核酸、酶、激素和多糖等的一项技术。
（一）原理
在纤维素与葡聚糖分子上结合有一定的离子基团，当结合阳离子基团时，可换出阴离子，则称为阴离子交换剂。如二乙氨乙基（Dicthylaminoethyl，DEAE）纤维素。在纤维素上结合了DEAE，含有带正电荷的阳离子纤维素―O―C6H14 N+ H，它的反离子为阴离子（如Cl- 等），可与带负电荷的蛋白质阴离子进行交换。当结合阴离子基团时，可置换阳离子，称为阳离子交换剂，如羧甲基（Carboxymethy，CM）纤维素。纤维素分子上带有负电荷的阴离子（纤维素－O－CH2 －COO－），其反离子为阳离子（如Na+ 等）,可与带正电荷蛋白质阳离子进行交换。
溶液的pH值与蛋白质等电点相同时，静电荷为0，当溶液pH值大于蛋白质等电点时，则羧基游离，蛋白质带负电荷。反之，溶液的pH值小于蛋白质等电点时，则氨基电离，蛋白质带正电荷。溶液的pH值距蛋白质等电点越远，蛋白质的电荷越多。反之则越少。血清蛋白质均带负电荷，但各种蛋白质带负电荷的程度有所差异，以白蛋白为最多，依次为球蛋白，球蛋白和球蛋白。
在适当的盐浓度下，溶液的pH值高于等电点时，蛋白质被阴离子交换剂所吸附；当溶液的pH值低于等电点时，蛋白质被阳离子交换剂所吸附。由于各种蛋白质所带的电荷不同。它们与交换剂的结合程度也不同，只要溶液pH值发生改变，就会直接影响到蛋白质与交换剂的吸附，从而可能把不同的蛋白质逐个分离开来。
交换剂对胶体离子（如蛋白质）和无机盐离子（如NaCl）都具有交换吸附的能力，当两者同时存在于一个层析过程中，则产生竞争性的交换吸附。当Cl-的浓度大时，蛋白质不容易被吸附，吸附后也易于被洗脱，当Cl- 浓度小时，蛋白质易被吸附，吸附后也不容易被洗脱。因此，在离子交换层析中，一般采用两种方法达到分离蛋白质的目的。一种是增加洗脱液的离子强度，一种是改变洗脱液的pH值。pH值增高时，抑制蛋白质阳离子化，随之对阳离子交换剂的吸附力减弱。pH值降低时，抑制蛋白质阴离子化，随之降低了蛋白质对阴离子交换剂的吸附。当使用阴离子交换剂时，增加盐离子，则降低pH值。当使用阳离子交换剂时，增加盐离子浓度，则升高溶液pH值。

（二）常用离子交换剂的种类与特性

1.离子交换纤维素离子交换纤维素的种类很多，其种类与特性如表1－1所示。

表1-1 离子交换剂的类型与特点

交换剂	名称（纤维素）	作用基团	特点
阴离子交换剂	二乙氨基乙基	DEAE⁺ -O-C₂ H₄ N⁺ (C₂ H₅ )₂ H	最常用在pH8.6以下
三乙氨基乙基	DEAE⁺ -O-C₂ H₄ N⁺ (C₂ H₅ )₂ H
氨乙基	AE⁺ -O-C₂ H₄ -N H₂
胍乙基		强碱性、极高pH仍有效
阳离子交换剂	羧甲基	CM^― -O-CH₂ -COO^―	最常用在pH4以上
磷酸	P^－ -O- P O₂ ^－	用于低pH
磺甲基	SM^－ -O-CH₂ -SO₃ ^－
磺乙基	SE^－ -O-C₂ H₄ -SO₃ ^－	强酸性用于极低pH

在交换纤维素中，最常用的是DEAE―纤维素和CM纤维素。由于剂型不同，其理化性质和作用也有所差异。一般而言，微粒型要优于纤维素型，因为微粒型是在纤维素型的基础上进一步提炼而成。它的交换容量大，粒细、比重大，能装成紧密的层析柱，要求分辨力高的实验可用此型纤维素（见表1－2）。

表1-2 商品DEAE―纤维素和C M纤维素的类型和特性

纤维素	形状	长度	交换当量（毫克当量/克）	蛋白质吸附容量（mg /g牛血清白蛋白）	床体积（ml / g）
pH 6.0	pH 7.6
DE-22	改良纤维	12~400	1.0±0.1	450	7.7	7.7
DE-23	改良纤维（除细粒）	18~400	450	8.3	9.1
DE-32	微粒型（干）	24~63	660	6.0	6.7
DE-52	微粒型（湿）	24~63	660	6.0	6.3
DE-11	旧型号	50~250	130
	与以上相应型号同		溶菌酶pH5
CM-22	0.6±0.06	600	7.7	7.7
CM-23		600	9.1	9.1
CM-32		1 260	6.8	6.7
CM-52	1.0±0.1	1 260	6.8	6.7