细胞凋亡检测：形态学特征的检测方法-2
二、透射电子显微镜观察方法
培养细胞的取材和固定
1、常规收集帖壁和悬浮细胞，置离心管中离心， 800 ～ 1000r/min ， 10min 。
2、用 0.01mol/L PBS 5ml 重悬细胞。
3、将细胞悬液吸入有琼脂空槽的离心管中。
4、离心， 2000r/min ， 15 ～ 20min ，使细胞成团。
5、小心吸去上清，加入 2.5 ％戊二醛固定液固定细胞团，以免细胞团散开。
6、取出离心管内的琼脂，仔细切下尖槽内含有细胞团的琼脂块。
7、将含细胞的团琼脂块投入含戊二醛固定液的小瓶中， 4 ℃（可长期）保存。
8、用 0.1mol/L PBS 缓冲液洗 1 次。
9、1 ％锇酸后固定 30 ～ 60min 。
三、荧光显微镜观察方法
（一）吖啶橙染色法
1、制备活细胞悬液，浓度约为 107 /ml 。
2、取 95 μ l 的细胞悬液，加 5 μ l 的吖啶橙贮存液混匀。
3、吸一滴混合液点洁净玻片上，直接用盖玻片封片。
4、荧光显微镜选用激发滤片 BG 12 或 BV 等，阻断滤片用 515nm 或 SP3 。
（二） Hoechst33258 染色法
1、原代细胞培养，细胞学涂片或细胞甩片机制备的单细胞片。
2、细胞固定液 4 ℃固定 5min 。
3、蒸馏水稍洗后，点加 Hoechst33258 染色液， 10min 。
4、蒸馏水洗片后，用滤纸沾去多余液体。
5、封片剂封片后荧光显微镜观察。
（三） Hoechst33342 染色法
1、将 Hoechst33342 加入培养的细胞中，终浓度为 10 μ g/ml 37 ℃孵育 30min 。
2、4 ％的多聚甲醛和培养液以 1 ： 3 混合，使多聚甲醛的浓度为 1 ％，固定细胞 5 ～ 10min 。
3、固定好后，将细胞悬液涂在载玻片加盖玻片。
4、荧光显微镜激发滤片选用 UV 激发滤片，阻断滤片为 400 ～ 500nm 。
以上是先将细胞染色后再行固定观察的方法，也可先固定后染色：
1、 收集（ 0.5 ～ 3.0 ）× 106 个细胞， 500 ～ 1000r/min ，离心 5min 去上清。
2、PBS 洗 1 次， 500 ～ 1000r/min ，离心 5min 去 PBS 。
3、用 3 ％多聚甲醛 50 μ l 重悬细胞，室温下固定 10min 。
4、PBS 洗 1 次， 500 ～ 1000r/min 离心 5min 去 PBS 。
5、用 15 μ l 的 Hoechst33258 或 33342 重悬细胞，终浓度为 16 μ g/ml ，孵育 15min 。
6、取 10 μ l 放在玻片上，荧光显微镜下观察，可数 500 个细胞，计算调亡率。
