农作物种子纯度鉴定方法综述3
4分子标记鉴定法
广义的分子标记是指可遗传的并可检测的DNA序列或蛋白质。蛋白质标记包括种子贮藏蛋白和同工酶(指由一个以上基因位点编码的酶的不同分子形式)及等位酶(指由同一基因位点的不同等位基因编码的酶的不同分子形式)。狭义的分子标记概念只是指DNA标记，而这个界定现在被广泛采纳。由于DNA分子中碱基的缺失、插入、易位、倒位、重排或由于长短与排列不一的重复序列等而产生多态性，DNA分子标记便是检测这种多态性的技术，故DNA分子标记技术又称作分子诊断技术。分子标记能反映生物个体或种群间基因组中某种差异特征的DNA片段，它直接反映基因组DNA间的差异。与上述三种鉴定法相比较，分子标记具有许多明显的优点，表现为：(1)直接以DNA的形式表现，在生物体的各个组织、各个发育阶段均可检测到，不受季节、环境限制，不存在表达与否等问题；(2)数量极多，遍布整个基因组，可检测座位几乎无限；(3)多态性高，自然界存在许多等位变异，无须人为创造；(4)表现为中性，不影响目标性状的表达；(5)许多标记表现为共显性的特点，能区别纯合体和杂合体，提供完整的遗传信息。分子标记的这些优点，使它己广泛用于植物分子图谱的构建、植物遗传多样性分析与种质鉴定、重要农艺性状基因定位与图位克隆、转基因植物鉴定、子标记辅助育种选择等生命科学的理论和应用研究中。
生物在长期的进化过程中产生了许多由DNA碱基序列变异所致的可遗传变异。这些DNA碱基序列变异主要有DNA重排、碱基替换、缺失、插入、倒位、易位和序列重复等多种形式。分子标记技术正是以物种内这种存在着极为丰富的DNA碱基序列变异为基础而开发起来的。
4．1 RFLP (Restr iction fragment length pOlymorphism，限制性片段长度多态性标记）
该技术由Grodzicker等于1974年创立，1980年由Botstein再次提出，并由SOLLER和Botstein(1983)最先应用于品种鉴别和品系纯度的测定，这是第一个被应用于遗传研究的DNA分子标记技术。
RFLP是在分子克隆技术基础上发展起来的一种遗传标记。特定生物类型的基因组DNA，经某一种限制性内切酶完全酶解后，会产生分子量不同的同源等位片段，或称限制性等位片段。RFLP标记技术的基本原理，就是通过电泳的方法分离和检测这些片段。凡是可以引起酶解位点变异的突变，如点突变(新产生和去除酶切位点)和一段DNA的重新组织(如插入和缺失造成酶切位点间的长度发生变化)等，均可导致限制性等位片段的变化，从而产生RFLP多态性。该技术包括以下基本步骤：DNA提取；用DNA限制性内切酶消化；凝胶电泳分离限制性片段；将这些片段按原来的顺序和位置转移到易操作的滤膜上；用放射性同位素或非放射性物质标记的DNA作探针与膜上的DNA杂交(称Southern杂交)；放射性自显影或酶学检测显示出不同材料对该探针的限制性酶切片段多态性，即可产生和获得反映生物个体或群体特异性的RFLP图谱。RFLP分析中所使用的探针，通常是随机克隆的与被检测物具有一定同源性的单拷贝或低拷贝基因组片段或cDNA片段。
RFLP指纹图谱的优点主要表现在：第一，可靠性较高。因为它由限制性内切酶切割特定位点产生；第二，来源于自然变异。依据DNA上丰富的碱基变异无需任何诱变剂处理；第三，多样性。通过酶切反应在DNA水平上来反映所有差异，且RFLP标记遍布于整个基因组，故而在数量上几乎没有任何限制；第四，共显性。RFLP标记能够区别杂合体与纯合体；第五，无表型效应。不受发育阶段及器官特异性限制。
但是RFLP指纹技术也有其固有的缺陷，首先是操作烦琐，相对费时、周期长，且DNA需要量大、要求高，检测技术繁杂；其次是具有种属特异性，且只适应单 ／低拷贝基因，限制了其实际应用；再次，RFLP标记通常要使用同位素杂交，对实验员健康极为不利。即使用非放射性的Southern杂交技术，仍然耗时 费力。最后它最主要的缺点是由于它的信息产生是因为碱基突变而导致的限制性酶切位点的丢失或获得，所以RFLP多态位点数仅1～2个，多态信息含量低，仅 o．2左右。故而RFLP标记存在一定的局限性，较难以用于大规模的育种实践中。
