农作物种子纯度鉴定方法综述4
4．2 SSR(Simple sequence repeat，简单序列重复标记)
由Moore等于1991年创立。SSR即微卫星DNA，是一类由几个(多为1～5个)碱基组成的基序(motif)串联重复而成的DNA串联重复序列，其长度一般较短，广泛分布于基因组的不同位置，如(cA)n、(AT)n、(GGC)n等重复。不同遗传材料重复次数的可变性，导致了SSR长度的高度变异性，这一变异性正是SSR标记产生的基础。尽管微卫星DNA分布于整个基因组的不同位置，但其两端序列多是保守的单拷贝序列，因此可以根据这两端的序列设计一对特异引物，通过PCR技术将其间的核心微卫星DNA序列扩增出来，利用聚丙烯酰胺凝胶电泳分析技术比较扩增带在胶板的不同距离，来判断不同生物体的特定SSR座位多态性，就可获得其长度多态性即SSR标记。
SSR标记的主要特点有：(1)数量丰富，广泛分布于整个基因组；(2)具有较多的等位性变异；(3)共显性标记，可鉴别出杂合子和纯合子；(4)实验重复性好，结果可靠；(5)但是由于创建新的标记时需知道重复序列两端的序列信息，因此其开发有一定困难，费用也较高。
4．3 AFLP(AmpI ified fragment length polymorphism)
AFLP又名限制片段选择扩增技术(selective Restriction Fragment Amplification，SRFA)。AFLP标记是选择性扩增基因组DNA酶切片段所产生的扩增产物的多态性，其实质也是显示限制性内切酶酶切片段的长度多态性，只不过这种多态性是以扩增片段的长度不同被检测出来。该技术结合了RFLP的稳定性和PCR技术的简便高效性，同时又能克服RFLP带型少、信息量小以及RAPD技术不稳定的缺点。其基本技术原理和操作步骤如下：首先用限制性内切酶酶解基因组DNA，形成许多大小不等的随机限制性片段；接着在这些片段的两端连接上特定的寡聚核苷酸接头(0ligo nuleotideadapter)；然后根据接头序列设计引物，由于限制性片段太多，全部扩增则产物难以在胶上分开，为此在引物的3’端加入1～3个选择性碱基，这样只有那些能与选择性碱基配对的片段才能与引物结合，成为模板被扩增，从而达到对限制性片段进行选择扩增的目的；最后通过聚丙烯酰胺凝胶电泳，将这些特异性扩增产物分离开来。
AFLP标记的主要特点有：(1)由于AFLP分析可以采用的限制性内切酶及选择性碱基种类、数目很多，所以该技术所产生的标记数目是无限多的；(2)典型的AFLP分析，每次反应产物的谱带在50～100条之间，所以一次分析可以同时检测到多个座位，且多态性极高；(3)表现共显性，呈典型孟德尔式遗传；(4)分辩率高，结果可靠。(5)但目前该技术受ZL保护，用于分析的试剂盒昂贵，实验条件要求较高。
4．4 RAPD(Random amp I ification polymorphism DNA，随机扩增多态性DNA标记)
RAPD以PCR技术为背景，以人工合成的碱基顺序随机排列的寡核苷酸单链为引物(长度为9～10个碱基)，对所研究的基因组DNA进行PCR扩增，产生不连续的DNA产物，然后用电泳技术，以检测DNA序列的多态性，这些扩增片段的多态性反映了基因组相应区域的多态性。
RAPD标记技术就是用随机引物(一般为8～10个碱基)非定点地扩增基因组DNA，然后用凝胶电泳分开扩增片段。遗传材料的基因组DNA如果在特定引物结合区域发生DNA片段插入、缺失或碱基突变，就有可能导致引物结合位点的分布发生相应的变化，导致PCR产物增加、缺少或发生分子量变化。若PCR产物增加或缺少则产生RAPD标记。
RAPD标记的主要特点有：(1)不需DNA探针，设计引物也无须知道序列信息；(2)显性遗传(极少数共显性)，不能鉴别杂合子和纯合子；(3)技术简 便，不涉及分子杂交和放射性自显影等技术，实验设备简单、周期短；(4)DNA样品需要量少(15～25ng)、无放射性、引物价格便宜、成本较低； (5)但是RAPD标记多数位座的标记带表现为显性，信息不完整，且扩增出的产物稳定性差，实验重复性较差，结果可靠性较低。
