exFoxp3 Th17细胞对自身免疫关节炎的作用机制研究（二）
第三问 怎么成为我
小编：等等等等，不按逻辑出牌呢，不是应该问我要去哪么
我：去去，别打岔，我有更深刻的问题要思考，我是怎么成为现在这个样子的？这对理解关节炎发生的机制很重要
上述实验结果中可以发现ex Foxp3 TH17细胞在炎症关节中聚集，作者假设关节中存在细胞与Foxp3+T细胞反应，促使其转变为TH17细胞。设计实验从关节炎小鼠中分离Thy1+CD11b-细胞（滑膜成纤维细胞）和Thy1-CD11b+细胞（滑膜巨噬细胞）与Foxp3+CD4+T细胞（从未处理的Foxp3hCD2小鼠中分离）共同培养，Thy1+CD11b-细胞下调了Foxp3+CD4+T细胞中Foxp3表达（图3a）。将Thy1+CD11b-细胞与Foxp3+CD4+T细胞或naïve CD4+ T细胞共同培养，检测IL17+ Foxp3-细胞比例变化及细胞因子的表达（IFN-γ、IL-4），结果显示滑膜成纤维细胞使exFoxp3 T细胞上调了IL-17的表达水平，IFN-γ和IL-4表达没有变化，表明滑膜成纤维细胞在关节中促使Foxp3+T细胞转变为TH17细胞。Naïve CD4+ T细胞没有促使发生这一转变。进一步研究这一转变发生的机制，将Thy1+CD11b-细胞和与Foxp3+CD4+T细胞共同培养的上清液与细胞分离分别检测（图3d），发现细胞并不能引起这个转变；检测和分析上清液的细胞因子表达，结果显示Thy+CD11b-细胞上清产生较高的IL-6因子，并在IL-17存在的情况下，IL-6表达进一步加强（图e）。加入抗IL-6抗体抑制了exFoxp3+ TH17细胞的产生。证明来源于滑膜成纤维细胞的IL-6是促使Foxp3+CD4+T细胞转变为TH17细胞的关键因素。
Figure 3. Arthritic synovial fibroblasts promote the conversion of Foxp3+ T cells to TH17 cells in an IL-6– dependent manner. .
第四问 我有什么高(xie)超(e)的能力
破骨细胞是造成关节炎骨破坏的重要因素。为了评估TH17细胞在关节炎中对骨破坏的影响程度，作者通过破骨细胞（TRAP染色的多核细胞，TRAP+MNs）计数和RANKL、细胞因子表达，检测其诱导破骨细胞生成的能力。将Foxp3hCD2小鼠与IL-17-GFP小鼠（该小鼠来源于百奥赛图哦）交配，方便提取IL-17表达细胞。exFoxp3 TH17细胞、Foxp3+T细胞、IL17a-/-TH17细胞分别与滑膜成纤维细胞、骨髓源肥大和巨噬前体细胞（BMMs）共同培养，结果显示，exFoxp3 TH17细胞比TH17细胞（naïve CD4+T细胞来源的）具有更强的破骨细胞生成能力（图4a,b）。 TH17细胞的诱导破骨细胞生成能力主要来自IL-17的表达，IL-17可以刺激成纤维细胞上RANKL表达， TH17细胞虽然本身也产生RANKL，但细胞自身单独没有办法诱导破骨细胞生成。而IL17a-/- exFoxp3 TH17细胞缺失IL-17A表达仍可以诱导破骨细胞生成，说明是T细胞来源的RANKL或细胞因子而不是IL-17A对破骨细胞生成有潜在影响（图4b）。作者发现exFoxp3 TH17细胞比naïve CD4+T细胞来源的TH17细胞 表达了更高水平的RANKL，经过滑膜成纤维细胞共同培养，RANKL表达进一步增强。（图4c）
如图4d，exFoxp3 TH17细胞与BMMs共同培养，发现在没有滑膜成纤维细胞存在的时候，exFoxp3 TH17细胞也有将BMMs诱导生成破骨细胞的能力。为了探究RANKL对exFoxp3 TH17细胞和滑膜成纤维细胞的影响，文中在共同培养系统中使用exFoxp3 TH17细胞（从Lck-cre（T淋巴细胞特异cre小鼠） Tnfsf11（编码RANKL）flox/△ Foxp3hCD2 小鼠中分离）或Tnfsf11缺失的滑膜成纤维细胞。结果表示RANKL的表达是滑膜成纤维细胞促使破骨细胞生成的关键因素，而在没有表达RANKL的滑膜成纤维细胞存在下，exFoxp3 TH17细胞中RANKL的表达也能够促使破骨细胞生成（图4e，f）。
用GeneChip分析exFoxp3 TH17细胞和TH17细胞（naïve CD4+T细胞来源的），相比之下，exFoxp3 TH17细胞表达了更高的Ccr6、Ccl20、Il23r，Il17re，Tnfrsf21，Vcam1，Rorc和Tnfsf11，较低的Csf2，Tnf，Il10和Sgk1。结果说明exFoxp3 TH17细胞与多数已知的致病性的TH17细胞亚群并不相同，组成一种新的致病性TH17细胞亚群。
看看，同样都是TH17细胞，我是exFoxp3 TH17细胞，我的祖先是exFoxp3 T细胞，通过获得了激活TH17变化而来的，跟其他TH17细胞就是不一样哦! （高唱：“我们不一样！”）
Figure 4. exFoxp3 TH17 cells are osteoclastogenic T cells with distinct gene profiles.
第五问 我的家族在关节炎中有哪些“贡献”
我的祖先是exFoxp3 T细胞，来自CD25loFoxp3+CD4+ T细胞家族，我们家族好像很厉害的样子呢，让我们一起来看一看它们对关节炎有哪些“贡献”吧。
胸腺来源的稳定的Foxp3+CD4+ T细胞与自身抗原有较高的亲和力，维持了自身耐受性。作者假设不稳定的Foxp3+CD4+T细胞也包含自我反应T细胞，并且在失去Foxp3表达之后导致关节炎发生。为了研究自身抗原特异性的exFoxp3 T细胞的作用，作者将CD25loFoxp3+、 CD25hiFoxp3+、Foxp3-、效应记忆CD44hiFoxp3-CD4+T细胞（来源于胶原免疫的DBA/1 Foxp3hCD2小鼠）标记CFSE，转移到免疫小鼠模型中， CD25loFoxp3+细胞加速了关节炎发生，加重了症状。关节炎条件下，自身反应CD4+ T 细胞主要来源于CD25loFoxp3+CD4+ T细胞（图5a-c）。相比，CD25hiFoxp3+细胞显著抑制了破骨细胞的生成，几乎一半的CD25loFoxp3+细胞失去了Foxp3表达，几乎全部CD25hiFoxp3+细胞仍表达Foxp3（图5d）。体外二型胶原刺激后， CD25loFoxp3+细胞开始增殖，表明其包含更多的自身反应T细胞（图5e）。
Figure 5. Pathogenic role of exFoxp3 T cells to arthritis in vivo.
三、场景再现
场景：关节炎
主人公： ex Foxp3 TH17细胞
我是ex Foxp3 TH17细胞，属于pTreg细胞部落，从CD25loFoxp3+ CD4+ T细胞丢失Foxp3表达，聚集到关节，经滑膜成纤维细胞产生的IL-6转变而来。表达Ccr6、CCL20、IL23R、RANKL是我的标志，有较强的促破骨细胞发生能力，在关节炎的病理中有比较关键的作用。希望通过我的独白大家能够了解自身免疫关节炎中的发生机制和关键角色，我也能成为RA的标志物，预测抗IL-6抗体的治疗效果，进而发展成为自身免疫疾病的新的治疗手段。
本篇文章作者充分利用了基因编辑小鼠研究了自身免疫疾病的部分发生机制。
参考文献：
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2. Zhou, X., Jeker, L. T., Fife, B. T., Zhu, S., Anderson, M. S., McManus, M. T., & Bluestone, J. A. (2008). Selective miRNA disruption in T reg cells leads to uncontrolled autoimmunity. The Journal of Experimental Medicine, 205(9), 1983–1991.
3. Zhou, X., Bailey-Bucktrout, S. L.,
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Bluestone, J. A. (2009). Instability of the transcription factor Foxp3
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