荧光定量标准溶解曲线
全球大爆发的新型冠状病毒肺炎或新型冠状病毒感染疾病的诊断有多种方法，其中针对其病毒核酸的实时定量逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测是病原学诊断的金标准。PCR 方法是所有核酸（RNA、DNA）定量检测的重要方法，对于新冠病毒等RNA核酸首先需要逆转录为cDNA，而后PCR方法则基本一致，下面介绍PCR主要技术内容。
实验原理
PCR是以拟扩增的DNA分子为模板，以一对分别与模板互补的寡核苷酸片段为引物，在DNA聚合酶的作用下，按照半保留复制的机理沿着模板链延伸直至完成新的DNA合成。定量PCR就是在PCR扩增过程中，利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，以实现对起始模板进行定量分析一种技术方法，目标分子可以为DNA、cDNA或RNA。
定量PCR又被称Real-time PCR或是Quantitative Real-time PCR，其具体数据就是扩增曲线，基线，荧光阈值，Ct值和溶解曲线。扩增曲线主要是反映了定量PCR动态进程的曲线。荧光阈值是以前15个循环信号作为荧光本底信号（baseline），默认设置是3～15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍。基线（baseline），是指在PCR扩增反应的最初数个循环里，荧光信号变化不大，接近一条直线，这条直线就是基线。Ct 值就是荧光值达到阈值时候的PCR循环次数。溶解曲线是表示随温度升高DNA的双螺旋结构降解程度的曲线。总的DNA双螺旋结构降解一半的温度称为溶解温度（Tm），DNA中G-C含量越高，Tm值越高，成正比关系。
实验方法
常用荧光定量标记方法为非特异性荧光标记SYBR Green I。它是一种结合于所有dsDNA双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的染料。在游离状态下，SYBR Green I发出微弱的荧光，但一旦与双链DNA结合后，荧光大大增强。因此，SYBR Green I的荧光信号强度与双链DNA的数量相关，可以根据荧光信号检测出PCR体系存在的双链DNA数量。SYBR Green I 染料法的优点在于使用方便，不必设计复杂探针，且具有一定价格优势，他的缺点在与无模板特异性，对引物特异性要求较高且灵敏度相对较低。
另一种常用方法是Taqman 探针法，其在5’ 端标记有报告基团(Reporter, R) ，3’ 端标记有荧光淬灭基团(Quencher, Q)。当探针完整时，R发射的荧光能量被Q基团吸收，此时无荧光，在PCR进行过程中，探针被水解，R与Q分开，此时R就能发出荧光。探针法的优点在于高度特异性，灵敏度较高，但其只适合于一个特定的目标，且价格较高。
还有分子信标法，是一种在5’和3’末端自身形成一个8个碱基左右的发夹结构的茎环双标记寡核苷酸探针，两端的核酸序列互补配对，导致荧光基团与淬灭基团紧紧靠近，不会产生荧光。PCR产物生成后，退火过程中，分子信标中间部分与特定DNA序列配对，荧光基因与淬灭基因分离产生荧光。
实验分析
PCR实验是否成功，可看内参照与样本的扩增曲线、CT值和溶解曲线，理想的CT值、平稳的扩增曲线、单峰的溶解曲线，是PCR实验的成功主要标志。常见问题如下：
1. 理想的CT值是多少？
答：一般来说CT值在30以下都可以认为实验结果是可靠的，如果CT值大于30那么基本上可以说明该基因没有扩增。但这也不是绝对的，还可以通过分析产物电泳结果，也可以分析溶解曲线。
2. 无Ct值出现
答：首先检查荧光信号的步骤是否有问题，其次可能是由于引物降解的缘故，可通过电泳检测引物完整性，如都没有问题，检测模板，可能存在模板量不足（较少稀释倍数），模板降解（避免样品制备中杂质的引入及反复冻融的情况，必要时需重新抽提RNA）。另外可以适当提高反应循环参数，一般要在35个循环以上，但过多的循环次数会增加背景值。
3. Ct值出现过晚（Ct>38）
答：扩增效率低，需优化反应条件，如重新设计更好的引物，适当降低退火温度等；还有可能是由于PCR反应成分的降解及PCR产物链过长导致。
4. 为什么复孔间CT值差异巨大？
答：这可能是因为配置混样后没有充分混匀，导致三个复孔间会出现差异。还有一种可能就是引物设计缺乏特异性或是引物与模板不匹配，这样也会导致复孔的结果出现差异，建议充分混匀反应mix，还是不行则考虑重设引物。
5. 溶解曲线如何分析？
答：一般正常的溶解曲线的峰应该出现在80℃以上且有且只有一个单一的峰，这样的实验结果是可靠的。
6. 溶解曲线存在多峰
答：如果内参组及对照组溶解曲线均存在双峰，这种情况说明可能基因组DNA出现污染，如内参组溶解曲线正常，目的基因组溶解曲线存在双峰，那么还有可能是引物设计不够优化，或引物浓度不佳，或镁离子浓度过高而导致的。另外模板基因组的污染也会造成多峰的出现。
7. 如何减少或去除引物二聚体
首先可以优化热循环条件，主要是提高退火温度；或可适当降低引物浓度，引物理想最终浓度为200nM，可降至50-100Nm；或考虑重新设计引物。
8. 引物设计需要注意哪几点？
答：一般引物设计的长度在17-25个碱基，碱基尽量随机均匀分布，G-C含量在40%-60%之间，45%-55%最佳。引物3’端的碱基通常为G或C，不易引起错配。引物不能含有自身互补序列，否则容易出现发夹结构，两个引物之间不应有多于4个的互补或同源碱基，不然易出现引物二聚体。产物长度80-150bp最好，最长是300bp。
9. 如何提高RT-PCR反应的灵敏度与特异性？
答：首先确定模板RNA完整性好，无DNA污染。使用适量的模板RNA，模板量太多会降低特异性，太少会导致扩增不出条带或条带太弱。设计引物时，避免在引物3’端含有互补序列，避免形成内部发卡结构。
10. 标准曲线线性关系不佳
答：可能加样存在误差，使样品浓度不成梯度关系。也可能标准品因反复冻融出现降解。另外引物或者探针设计不佳也能导致标曲问题。
