抗肿瘤药物研究及新药筛选（四）
三、抗肿瘤药物筛选及评价
以国立肿瘤研究所（Nationai Cancel Institute NCI)为代表的美国抗肿瘤药物筛选模式经历了三个发展阶段。
• 1955-1985年，以动物移植性肿瘤为基本模型，以动物生命延长率和瘤重抑制率为药物活性的基本评价指标，此阶段是以化合物为本位的体内筛选方法。
• 1985-1990年，NCI提出并在广泛研究和试点的基础上逐渐完善以人肿瘤细胞株为基础、疾病本位的体外抗肿瘤药物筛选模型。这阶段是新旧筛选模型并存，新的筛选体系逐渐取代旧筛选体系的过渡阶段。
• 1990-至今，以人肿瘤细胞株为基础、疾病本位的体外抗肿瘤药物筛选体系，其目的在于发现对某种组织类型肿瘤活性强但可能对其他组织类型肿瘤活性弱的化合物。在该体系中，样品先经过9大类60种人类肿瘤细胞株进行体外筛选，结果通过评估后，再进行裸鼠体内的人类肿瘤异种移植研究。
国内抗肿瘤药物筛选和研究体系虽与NCI相似，但也形成了自己的特点。
❶根据我国肿瘤发病情况，选择试验瘤株组成，主要选择白血病、肺癌、胃癌、结肠癌、肝癌、乳腺癌、卵巢癌等细胞株，相当一部分是细胞株是国内自己建的。
❷体外抗瘤谱试验选用了正常细胞株，综合考虑了受试样品对正常组织的毒性。
❸选用了人肿瘤耐药细胞株，测试受试样品的耐药逆转作用和耐药细胞株增殖的直接抑制作用，以期发现具有抗耐药作用的药物。
❹选用人血管内皮细胞株进行同步体外试验，初步考察受试样品是否具有血管生成抑制作用。
抗肿瘤药的临床前药理研究包括药效学和毒性研究两部分
抗肿瘤药物药效学需研究内容：
体外抗肿瘤试验、体内抗肿瘤试验
评价药物的抗癌活性时，以体内试验结果为主，同时参考体外试验结果以做出正确的结论。
四、体外抗肿瘤活性试验
目的：
❶对候选化合物进行初步筛选；
❷了解候选化合物的抗瘤谱；
❸为随后进行的体内抗肿瘤试验提供参考，如剂量范围、肿瘤类别等 。
体外试验常用方法有：
1、染料排斥法
试验原理：活细胞有排斥某些染料如伊红、台盼蓝、苯胺黑等的能力，而死细胞由于膜完整性的破坏，可被着色。因此培养的肿瘤细胞中加入这些染料，一定时间后，对着色和未着色的细胞进行计数，即可算出被杀死的细胞比例。
方法要点：向一定容积的待检细胞悬液加入定量的某种染液，最常用的是0.4%台盼蓝液，混匀，室温染色5-15min，将已染色的细胞悬液滴加至血细胞计数板，直接在光镜下计数活细胞数和细胞总数。
观测指标：按（未染色细胞数/细胞总数）X100%计算活细胞率，对照组活细胞率应在90%以上。根据活细胞率计算受试样品的半数致死剂量（IC50）作为药物抗肿瘤活性的指标。
2、四氮唑盐还原法
试验原理：四氮唑[MTT,3-(4,5-dimethylibiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide]是一种能接受氢原子的染料。活细胞线粒体中与NADP相关的脱氢酶在细胞内可将黄色的MTT转化成不溶性的蓝紫色的甲[月替] (formazan)，而死的细胞则无此功能。用二甲基亚讽(DMSO)溶解甲[月替]后，在一定波长下用酶标仪测定光密度值，即可定量测出细胞的存活率。
方法要点：受试样品处理细胞结束后，加入5mg/ml MTT液20微升/孔，继续培养四小时。再加三联液并培养过夜。在酶标仪上于570nm波长处检测OD值。
观测指标 直接指标为96孔板上各被测孔的OD值；然后按公式（对照组OD值-治疗组OD值）/对照组OD值×100%计算出相应的细胞生长抑制率；剧情况可进一步采用Logit法计算50%生长抑制浓度IC50值。
3、阿拉马蓝法
试验原理：非荧光性蓝色底物阿拉马蓝可被活细胞中的线粒体内的NADPH相关的脱氢酶类还原为强荧光性粉红色底物，采用微培养板自动读数仪在激发与发射波长分别为530nm和590nm处读取荧光强度值，与活细胞数呈良好的线性关系。
方法要点：细胞经受试样品处理后，加入10-20ul阿拉马蓝染液，继续培养一定时间，用微培养板自动读数仪在激发与发射波长分别为530nm和590nm处读取荧光强度值。
观测指标：根据荧光强度可以计算细胞生长抑制率，适当时可进一步计算IC50值。
