抗肿瘤药物研究及新药筛选（五）
4、磺酰罗丹明染色法
试验原理：SRB是一种蛋白质结合染料，粉红色，可溶于水。 SRB可与生物大分子中的碱性氨基酸结合。其在515 nm波长的OD读数与细胞数呈良好的线性关系。故可用作细胞数的定量。MTT法的一个缺点是OD值可随放置时间而变，而SRB法无此现象。因此更适用于进行大规模的试验。
方法要点： 用10%冷三氯乙酸与4℃固定已经受试样品处理的细胞1h，洗涤，干燥；加入4mg/ml SRB液100微升/孔 染色15min，1%冰醋酸洗涤，干燥；最后加入150微升/孔 的Tris溶液，在酶标仪上与515nm波长处检测OD值。
观测指标 同MTT法。另外，NCI目前采用以下指标评价化合物的体外抗肿瘤活性。测定的OD值包括对照组、加药组及加药时的细胞的OD值C、T、和T0。据此计算：
生长抑制率（%）=（T－T0）/（C—T0）×100% ；细胞死亡率（%）=（T—T0）/ T0 ×100% 。
按生长抑制率或细胞死亡率对样品浓度绘出量效关系曲线图，并求出：
GI50，即生长抑制率为50%时的样品浓度；
TGI，即生长抑制率为100%时的样品浓度：
LC50，即细胞死亡率为50%时的样品浓度。
5、集落形成法
试验原理：克隆原细胞具有持续增殖能力，当单个细胞分裂6代或6代以上时，其后代所组成的群体(集落)便含50个以上细胞。通过集落计数可对克隆原细胞作定量分析。它反映了单个细胞的增殖潜力，故能较灵敏地测定抗癌药的活性，日前被认为是一种较理想的检测方法。
方法要点：将浓度为500个细胞/ml的对数生长期细胞悬液2ml种至35ml的培养皿，并加受试样品适量，培养7d或更长时间，姬姆萨染色，解剖显微镜下计数含50细胞以上的集落。
观测指标：根据集落数计算集落形成率，对照组集落形成率不应低于40%，再计算用药组的集落形成抑制率，根据情况可进一步采用Logit法计算受试样品的IC50值。
集落形成率=集落数/细胞接种数X100%
集落形成抑制率=（1-用药组集落形成率）/对照组集落形成率X100%
6、生长曲线测定法
试验原理：在最适条件下，肿瘤细胞在培养液中呈指数生长，如取细胞数的对数与培养时间作图可得一条直线，故称此时为对数生长期。随着细胞密度不断增高，由于代谢产物的积聚及营养物的消耗，细胞生长逐渐减慢以致停止，此时称高坪期或稳定期。因此药物对细胞生长的影响可通过生长曲线反映出来 。
方法要点： 将浓度为10000个细胞/ml的对数生长期细胞悬液按每瓶5ml种至25ml的培养瓶，或按每孔100微升种至96孔板，并加受试样品适量，培养后分别于即刻和1、2、3、4、5、6、7d进行检测。前者可采用台盼蓝染色计数活细胞，后者可采用MTT法或SRB法读取OD值，并据此进行作图与计算。
观测指标 1、倍增时间(TD),将实际生在曲线进行直线回归求出0和t时刻的理论细胞数N0和N t，据此计算：TD=0.301t/（log N t—log N0）；2 增殖细胞杀伤率（%）=( N0—N0’)/ N0×100%；3 细胞生长饱和密度（N s），代表高坪期每毫升细胞数的均数。
药物与细胞共培养时间一般为48-72 小时，贴壁细胞需先贴壁24 小时后再给药。试验应设阳性及阴性对照组，阳性对照用一定浓度的标准抗肿瘤药，阴性对照为溶媒对照
a、体外筛选方法的优点：
❶操作简单；
❷用药量少；
❸取材可直接用于人体肿瘤；
❹得出结果快速；
b、体外筛选方法的缺陷：
❶细胞毒性易显阳性，有毒物质也常常显阳性，故假阳性率高；
❷非直接对肿瘤细胞作用的药物显示假阴性；
❸体外细胞并不能完全代表体内肿瘤的恶性细胞；
五、体内抗肿瘤活性试验
1、自发性肿瘤
2、诱发的肿瘤
3、移植性肿瘤
（a）皮下肿瘤模型
选择肿瘤生长旺盛且无溃破的荷瘤小鼠，颈椎脱臼处死，在无菌条件下（超净台或接种罩），用碘酒、酒精或新洁尔灭消毒动物皮肤，切开皮肤，剥离肿瘤。将瘤组织剪成1.5 mm3左右，用套管针接种于动物一侧或双侧腋窝皮下；或制成细胞悬液，然后按一定比例加入无菌生理盐水，一般每只小鼠接种肿瘤细胞数量为（1-5）×106。
（b）腹水瘤模型
无菌条件下，消毒动物皮肤，吸取生长良好的动物腹水，以生理盐水按一定比例稀释后接种于动物腹腔，接种细胞数量一般为（1-5）×106。
（c）原位接种模型
原位接种是指将来源于某脏器的肿瘤接种在动物的某脏器，如将人肝癌接种在裸小鼠的肝脏。原位接种不是常规的方法，但有其优越性，是鼓励使用的方法。主要有肺、肝、胃、肠、乳腺、颅内等原位接种方法。
小鼠肿瘤模型 淋巴细胞白血病腹水瘤L1210和P388、白血病L-615、宫颈癌U14、肝癌H22、Lewis肺癌、黑色素瘤B16、网织细胞瘤M5076、肠癌26、肠腺癌38、乳腺癌CD8F1、艾氏腹水瘤（EAC）、肉瘤-180等，以及各种小鼠肿瘤的亚型和耐药株等。
人癌裸小鼠移植瘤模型 应选用体外试验敏感细胞株进行体内抗人癌裸小鼠移植瘤试验。
模型建立和使用应注意：
❶移植瘤一般由相应的细胞株移植而建立，对细胞株和移植瘤的化疗敏感性应予了解；
❷ 移植瘤复苏后一般应传2-3代后再用于体内抗肿瘤试验；
❸ 对模型生长情况应全面了解，尤其是生长快的模型；
❹ 为了保持移植瘤的生物学特性和遗传特性，复苏后移植瘤体内传代应少于 15-20代 ；
给药方案和给药途径
分组当日开始给药，根据不同药物的代谢动力学和毒性反应等确定给药方案。给药途径应与推荐临床用药的途径相同。
给药次数较多，或被试物质溶解性较差，静脉给药有困难时，可考虑使用腹腔给药，但在评价药效时要注意这两种给药途径是有差别的。
可采取瘤周、瘤内、肌肉、皮下给药途径。腹水瘤试验时一般不能应用腹腔给药途径。
