植物蛋白质组学和糖基化实验（五）
1. 含高甘露糖型 N-糖苷糖蛋白的鉴定
本方法是我们实验室以油菜籽为实验材料建立的，本方法也适用于其他植物材料。
( 1 ) 将 6 g 植物材料放入 4°C 预冷的研钵中，加入 50 ml 预冷的 TBS 缓冲液，研磨萃取蛋白质（见注释 13)，接着 10000 g 离心萃取物 30 min，去掉不溶物，然后 150000 g 离心 1 h，沉淀膜碎片。用 Bradford 蛋白检测方法测定上清液中的可溶性蛋白浓度。将样品分装成每份含 20 mg 蛋白质，冷冻存备用。
( 2 ) 4°C 解冻一份 20 mg 的样品，10000 g 离心 30 min，0.20 μm 过滤膜过滤去除所有的不溶物。加入冷 TBS 缓冲液定容至 35 ml，加入 CaCl2 和 MgCl2 至终浓度为 1 mmol/L。
( 3 ) 将相当于 1 ml 刀豆蛋白 A-琼脂糖树脂重悬在 50 ml TBS 缓冲液中，用 50 ml 的 TBS 缓冲液冲洗树脂 2 次 ，每次冲洗后通过沉降或者离心（3500 g，10 min) 回收树脂。
( 4 ) 洗漆后的树脂与 35 ml 样品于 4°C，在旋转振荡器上振荡 2 h。将树脂倒入 PolyPrep 柱子中，冲洗去除未结合在柱子上的蛋白质。
( 5 ) 先用 50 ml TBS 缓冲液冲洗树脂 5 次，再用 50 ml TBS 缓冲液冲洗树脂 5 次，然后如步骤（3 ) 所述方法，用 50 ml TBS 缓冲液重悬树脂。
( 6 ) 将树脂倒入 Poly- Prep 柱子中，去除残余的 TBS 缓冲液，用 10 ml 含 0.3 mol/L α-甲基甘露糖 TBS 缓冲液重悬柱子中的树脂。置于 4°C 旋转振荡 1 h ( 见注释 14)。
( 7 ) 用 15 倍体积的含 0.3 mol/L α-甲基甘露糖的 TBS 缓冲液洗脱糖蛋白，用同样的溶液冲洗树脂，混合这两部分样品，最终的混合物就是纯化的连接高甘露糖型 N-糖苷的糖蛋白。
( 8 ) 用 Bradford 蛋白检测方法确定蛋白浓度，在 12.5% 三氯乙酸（最终浓度）中，4°C 过夜沉淀糖蛋白样品。10000 g 离心 15 min 沉淀蛋白，用丙酮/水 [ 9 : 1 ( V/V )] 溶液冲洗沉淀，再次离心。重复洗涤过程两次，将蛋白质溶解在适当的样品缓冲液中供 2D 电泳分析用。
( 9 ) 用 2D 凝胶分离糖蛋白，蛋白点通过胶态蓝染色。分别收集每个可视的点（见注释 15)。胰蛋白酶酶解收集到的蛋白点。用 LC-MS/MS 分析酶消化产物。提交获得的肽段序列信息到 NCBI 非冗余数据库在可选择的物种限制范围内，进行 “短的、几乎准确的匹配” blast 检索（http://www. ncbi. nlm. nih. gov/BLAST/)。
一经鉴定，糖蛋白应进行以下两点鉴别：① 它们是被分泌出来的，或其有一个潜在的信号肽吗？② 它们至少拥有一个潜在的 N-糖基化位点吗？一个蛋白质中的糖基化位点可通过与 Prosite 数据库（http : //npsa- pbil. ibcp . fr /cgibin / npsa _ autom at, p i ? page = npsa _ prosite , html 或 http：// www . expasy . org /tools /scanprosite / ) 比对确定。
2. O-位 N-乙酰葡糖胺糖基化蛋白的鉴定
鉴定 O-GlcNAc 糖蛋白质组需要麦胚凝集素（WGA) 亲和层析的糖蛋白纯化。之前的实验表明 WGA 既可以结合 O-GlcNAc 糖蛋白也可以结合带 N-糖苷的蛋白质[ 28] 。所以必须预先去除 N-糖苷，才能用亲和层析柱选择性地纯化 O 位 N-乙酰葡糖胺糖基化蛋白。这个去糖基化过程可通过能去除高甘露糖型和复合型 N-糖苷的肽 N-糖苷酶 F 来实现。但是如前所述，由于与邻近 N-糖苷中心 GlcNAc 连接的 α-1-3 岩藻糖的存在，肽 N-糖苷酶 F 对植物复合型糖苷的作用很有限 [ 见 25. 3. 2 节 3. 2 ]。为了克服这个不利因素，要让植物材料保持对 PNGaseF 敏感的高甘露糖型糖苷形式。本实验方法是我们实验室开发的用于将突变体的细胞培养物的 N-糖苷转变为 Man5GlcNAc2 结构 [29] 。这个实验方法应该适用于其他的植物材料，实现高甘露糖型 N-糖苷的糖基化。
( 1 ) 用神奇滤布过滤 150 ml 细胞培养物，然后将细胞培养物悬浮在 150 ml 0.5 mol/L NaCl 溶液中，4°C 搅拌 30 min 溶解以离子键结合细胞壁上的蛋白质（见注释 16 和注释 17)。
( 2 ) 用神奇滤布再次过滤细胞培养物。弃上清，在含 150 mmol/L KCl、2 mmol/L CaCl2、10 mmol/L MgCl2、1 mmol/L DTT 和蛋白酶抑制剂的 30 ml 20 mmol/L Tris-HCl，pH 7.8 ( WGA 缓冲液）中研磨细胞培养物。
( 3 ) 4°C 下萃取物经 5500 g 离心 15 min，接着 25000 g 离心 30 min 后，弃去不溶物，分装到 5 ml 管中。
( 4 ) 用 Centricon 离心超滤管（Amicon Bioseparation YM-10 ) 将 5 ml 的组分浓缩到 0.5 ml。
( 5 ) 浓缩后，加 SDS 到样品中使其含有 0.1% SDS，100°C 加热 5 min 变性处理糖蛋白。再加入 NonidetP40 使其终浓度为 0.5% ( 见注释 12)。蛋白质处理变性后，加入 PNGaseF ( 5 U )，37°C 搅动温育 24 h 进行蛋白质去糖基化反应。这一步骤中，只有 N-糖苷被消除掉。
( 6 ) 用 WGA 缓冲液将去糖基化样品稀释 20 倍，将其与 100 μl WGA-琼脂糖混合，4°C 旋转振荡 4 h。用柱体积 20 倍的 WGA 缓冲液冲洗树脂去除未结合在柱子上的蛋白质。
( 7 ) 为了洗脱结合在柱子上的蛋白质，将树脂与 5~10 倍体积的含 0.5 mol/L GlcNAc 的 WGA 缓冲液在 4°C 混 合 30 min ( 见注释 18)。收集洗脱液， 重复相同的洗脱处理一次。合并这两次洗脱液，这个糖蛋白组分只含有 O-位 N-乙酰葡糖胺糖基化蛋白质。
( 8 ) 加入三氯乙酸达到终浓度为 12.5%，4°C 过夜沉淀糖蛋白。10000 g 离心 15 min 沉淀蛋白质，用丙酮/水 [ 9 : 1 ( V/V ) ] 溶液洗涤蛋白沉淀 3 次，将蛋白质沉淀物悬浮在一种适当的缓冲液中供 1D 电泳备用。
( 9 ) 用 1D SDS-PAGE 凝胶电泳分离 O-位 N-乙酰葡糖胺糖基化蛋白质。经考马斯亮蓝染色后，收集胶内的所有可见条带，经胰蛋白酶消化后，用 MALDI-TOF 或 LCMS/MS 鉴定蛋白质。
3.5 结论与展望
应用本章所列的实验方法可获得一个植物糖蛋白的糖苷及其组成单元、连接方式的功能。事实上，相同的寡糖序列连接到不同的糖蛋白上，或出现在植物体内不同的位置，亦或出现在植物生活周期的不同时间，都可能表现出不同的功能。因此，新兴的糖蛋白质组学研究正，为了解 N-糖苷和 O-糖苷的作用，开劈一条新的途径。缩短这一领域的差距将拓展我们对于植物生理学的认识，也为生物化学和医学提供了更加广阔的前景。
