临检专业的现状，发展和对策
从主任给我一个题目,让我向大家介绍一下临床检方面的进展和谈谈我们的差距,确定我们今后的努力方向。
我想进展方面有三个，一个是各种自动化检则仪器的升级和使用一个是检测标准化的问题:再一个是一些新的检测项目陆续进入临床应用。
差距,我和各位主任的想法恐怕是一致的,主要不在技术和仪器本身上,而在工作的管理,特别是操作规范化、标准化、质量保证体系的运行和与临床的沟通上。
一、自动化检测仪器使临床检验工作面貌一新,但也带来新的问题
这些年来,血球自动化计数仪,尿液分析仪,凝血仪,血沉仪以及各种快速,便捷的试剂条,试验卡广泛地应用在门诊、病房和急诊的常规检验工作中,不仅大大地提高了工作效率,缩短了检验时间,方便了病人,也减轻了操作人员的劳动强度,使临检工作面貌一新。但是,也带来新的问题。有的工作人员过分地依赖仪器报告的数据,忽视了显微镜检查,造成漏诊和误诊,特别是急性白血病、血小板疾病的漏诊和误诊率较高。尿液检查自使用尿分析仪以后,本应当加强对检测报告的分析把关,必要时一定要进行显微镜检查,并以显微镜检查为准,但是,执行得不认真,也给临床和病人带来许多问题。
我们必须清楚,仪器分析的方法学和我们传统的显微镜检查有根本的区别,两者目前还有一个很好的对应关系。
比如,血球分析仪从简单的两分类,三分类,到现在的五分类仪器,使用得越来越多。当然,五分类仪器由于采用除电阻抗原理外,还吸收了电导,光散射原理,形成所谓的VCS技术甚至有的仪器还应用了射频技术,细胞化学染色技术,多角度偏振光散射技术。在仪器功能方面,许多仪器都使用了计数周期的控制技术，样品进样和防堵孔技术为了保证血细胞计数的准确性,特别是血小板计数的准确性,许多仪器采用了计数周期的控制技术,样品进样和防堵孔技术为了保证血细胞计数的准确性,特别是血小板计数的准确性,许多仪器采用了扫流技术,鞘流技术，防返流装置Von Behrens感应器,延迟计数,浮动界标和拟合曲线等措施。但是,不论生产厂家采取什么样的技术和措施,仪器如何升级换代,都代替不了人工显微下对细胞形态的真实观察。此外,越是高档次的仪器对标本的要求也就越苛刻。
Sysmex
SF-3000是一台五分类的高档血球分析仪,它通过分类(DIFF)和白细胞/嗜碱性粒细胞(WBC/BASO)2个测试通道,采用流式细胞仪原理和半导体激光技术进行白细胞分类的,但是仪器仍然有三种提示旗号:（1）Imm
Gran(未成熟粒细胞)(2)NRBC/PLTC(有核红细胞/血小板凝集)(3)Blast/Aty(原始细胞/异常淋巴细胞)。天津市等三中心医院检验科的高洁,许宏敏,卢普美同志、总结了182例仪器检查有异常提示病例,结果是该仪器对异常细胞检出的特异性为72.2%,敏感性为98.2%,检出有效率为80.2%。具体可见表1,2。
为什么仪器的假阳性率如此高,分析其原因有二:一是仪器设置的警示阀较低,为的是提高仪器的灵敏度,以减少漏诊二是与工作条件有关,仪器负荷重,稳定性减低,可使警示阀改变。
即使是目前最先进的Sysmex HST-300全自动血液分析工作站,它是由主机SE-9000,R-3500和SP-100组成,分别采用了电阻、射频和流式细胞仪等技术,不仅可以对白细胞进行五分类,还可以计数网织红细胞以及自动推片、染色。但是仍然有自动报警设计,通过IMI(未成熟细胞)来识别幼稚细胞,提高仪器对异常细胞的检出率,也不能完全取代显微镜检查。
更何况,仪器越先进、高级,对试验条件的要求也就越高,你稍不注意,报警装置就会经常给你发出各种警示旗号,弄得你不知道要不要进行人工复查。
因此,做为检验科主任必须要求我们的具体操作者,严格按照规范化操作程序进行,这些程序必须文件化,写入实验室操作手册,每个人都必须严格执行。
又如,尿液分析从尿8项分析仪,发展到尿10项分析仪,为了控制维生素C对尿糖、尿蛋白等检测的干扰,又推出了尿11项分析仪,这些仪器大家都已经很熟悉了。但是,尿液的干化学检查仅是尿液检查的过筛试验,并不能做为泌尿系统疾病的诊断试验。
尿沉渣检查对临床诊断泌尿系统疾病很重要,但操作起来很麻烦,又不规范,所以,尿沉分析仪也研制开发出来并已经推向市场。美国DiaSys
R/S2003尿沉渣定量分析工作站和日本Syemex
UF-100尿沉查分析仪就是其代表,国内一些生产厂家也在推出自己国产的尿沉渣分析仪,看来,大有普及的趋势。上述两种尿沉渣分析仪的原理不同,各有优点。
例如Syemex UF+100尿沉渣分析仪采用了流式细胞仪和电阻抗原理,根据尿液中不同有形成分的荧光强度,前向角散射光强度和细胞通过产生的电阻抗分别落在不同的区域,打印出红细胞,白细胞的直方图和各有形成分的散点图。DiaSysR/S2003尿沉渣定量分析工作站则完全依靠光学显微镜的对有形成分的形态观察,不仅可将有形成分具体地显示在显示器的荧屏上供操作人员分析,而且可以通过一个固定的流动计数室对细胞等有形成分进行定量计数。虽然,这两种尿沉渣分析仪原理不同,但都克服了操作者主观性造成的误差,提高了检测的精密度和准确度,并使尿沉渣检查规范化和标准化。但是,是不是有了尿沉渣分析仪,我们就可以完全依靠它,而放弃显微镜检查呢?显然不能这样。更何况,仪器不能对白细胞进行分类计数,而尿液中白细胞的分类检查对临床诊断感染性疾病和免疫性疾病是非常关键的。况且,在这些尿沉渣分析仪没有普及情况下,目前我们大多数医院的人工尿沉渣检查现状如何?恐怕主任们心中有数。
粪便检查的现状也不令人满意,首先我们国家临床医生对粪便检查的目的性不明确,好象不是很有目的,而是一种常规,有病必查粪便。有人报告,国外住院病人检查粪便的不足10%,而我们医院可能高达70%以上。大量无意义的劳动占去我们病房检验人员的时间,又如何能把注意力集中在有问题的标本上呢?就我们自身来讲,我们又有多少人能准确识别粪便中不同的寄生虫卵?肠道传染病发病率始终居高不下,除了痢疾杆菌之外,出血性大肠杆菌O157:H7,成为新的致病菌,危害很大抗生素的大量和不适当的使用,肠道菌群失调性腹泻发生率逐年增加由于艾滋病的蔓延,隐孢子虫感染也成为一个重要的临床问题,这些都对我们粪便微生物的快速检查,快速诊断提出的新的要求,当然不仅是快速,更应当强调准确。
再如,各种半自动,全自动凝血仪基本上已经完全取代了手工操作,PT试剂也有了ISI值,是不是凝血检查就不存在问题了?我举个例子,大家都知道,报告病人PT和APTT结果时,一定要同时报告正常对照的PT和APTT测定值,以便让临床医生判断患者的PT和APTT的参考范围固定编进仪器的计算机系统,正常对照不用做了,正常对照不是一个具体数字,而是一个范围,这符合要求吗?还有,试剂的ISI在你这个仪器上,有没有改变,按照试剂的ISI值,计算不同仪器的INR有没有差异?如果有差异,对临床口服华法令的监测有何影响?如何解决?
此外,计算机图象识别能力软件的开发和应用也给我们传统的显微镜检查带来新鲜的内容,比如现在市场上正在宣传的多功能显微图象分析系统,除了可以对骨髓细胞进行形态学分析,还可以对染色体,精子进行分析,当然这些分析都是计算机模拟进行的,准确度多在90%左右,但对疑难病例和不典型的形态学变化,仍需要人工检查。又如,根据细胞核仁区非组蛋白硝酸银染色原理建立的KL-型肿瘤免疫图象分析系统以及根据荧光染色和激光照射的原理设计的网织红细胞自动分析仪等。虽然这些技术本身是建立在显微镜检查的客观基础上,但是仍然存在操作规范化或标准化的问题,不同的软件对细胞分析判断上也有不同,如何做到一致和标准化?
血液流变学检测义器目前市场上比较混适,各个生产厂家都在竭力宣传自己的产品,但是国家尚没有统一的行业标准,只有企业标准,临床应用中缺乏规范化操作程序,又没有符合要求的质控物,仪器不能定期进行校准,所有这些问题都使得血液流变学参数的临床意义大打折扣,很难得到临床医生的认同。
二、检测过程的规范化和标准化已成为我们面临的最紧迫的问题
规范化和标准化的含义是不同的,规范化是指某项工作的一致性或称统一性,大家都按这个程序或步骤去做相同一件工作,大家的工作就有了可比性标准化是指制定一个条件,一个程序,它首先要达到满足质量要求并可溯源到国际或国内最高标准的,大家都应遵守的一套工作程序。可以说,实现标准化就实现了规范化,但规范化的东西不一定都符合标准化的问题。
(一)血细胞计数的规范化
1.规范化
(1)采血的部位,抗凝剂的使用,容器的选择,标本的保存,标本的稀释:
这里我只提一下测定时间对质量的影响。
EDTA抗凝的末梢血应至少在15分钟以后进行测定,因为在这段时间内有些标本血小板有暂时的聚集现象,使血小板计数假性减少,这不仅影响血小板其他指标的准确性,也造成红细胞计数有所增高。取血后立即检测,标本的血小板和白细胞体积分布直方图可能是异常的,放置一段时间后在测定就可得到分布正常的直方图。
(2)试剂的配套使用,特别是溶血剂的正确选择和使用:
全自动血液分析仪可以控制溶血剂的加入量及溶血剂作用时间。但在使用半自动血细胞计数已进行血细胞计数时,需要在血液予稀释后人工加入溶血剂,溶血后在进行血细胞计数和分类计数,正确掌握溶血剂用量及溶血时间非常重要。如果加入量不足或加入后放置时间过短,可以造成溶血不完全,使未溶解的红细胞计如白细胞中,造成白细胞假性增加。溶血不完全也可以使血红蛋白测定偏低。如果加入溶血计量过多或放置时间太久白细胞明显变形,使白细胞直方图异常,白细胞分类计数结果不准确,甚至不能进行分类计数。
(3)标本自身的干扰因素:
其中血小板计数最容易受干扰,大家都很清楚,血小板计数的范围(又称计数阈)是2-24fl,3-20fl为准确计数阈,20-24fl为血小板计数的漂浮阈。小红细胞体积<24fl,计入血小板,使血小板假性增高巨大血小极和血小板聚集,计入红细胞,使血小板计数假性减低。
(4)工作环境的监测。
(5)新仪器或新监测系统的性能评价。
(6)仪器的校准。
仪器使用一段时间后,必须进行校准。校准前应彻底清洗管道,去除管道中的残留血液,吸附的蛋白和纤维等,然后测定试剂空白,本底符合要求(一般要求红细胞、白细胞,血小板和血红蛋白四项本底为0)。要检查标准物是否在有效期内,外观有无变化。从冰箱取出后,要平衡至室温,轻轻混匀。在仪器上测定标准物11次,第1次数据不用,从第2次到11次,计算均值,标准差,绝对误差和相对误差。判断标准结果,必须达到标准要求。见表3。
如果各参数的绝对误差和相对物产小于一级要求,属合格,不须做任何校准如果参数大于一级要求,而不小于二级要求,可按仪器说明书要求调整系数。调整后应再测定另一瓶全血校准物,应当达到一级要求。如果结果大于二级要求,则需通知厂家修理和调整,此时仪器应停止使用。
(7)室内质控制措施
(8)室间质评的评估和分析
(9)纠正措施和实施记录
(10)人工显微镜复查的规定。
2.人工显微镜复查的规定
中华医学检验学会1995年在武夷山会议上曾就在使用自动化血球计数仪当中进行必要的人工显微镜复查提出过一个标准,其中规定凡出现以下情况之一者,都应当进行显微镜复查:
(A)血细胞计数结果明显异常；
(B)血细胞直方图异常
(C)出现警示旗号。
可是我们很多具体操作人员在日常工作中并没有严格执行,而是想起来就做,想不起来就不做有的异常就做,有的异常就不做,各有各的"标准",这种情况必须加以纠正,统一到规范化规定上来。
(1)有人问,血细胞计数明显异常如何掌握?
可以从两个方面掌握,一个是试验允许误差,一个是医学决定性水平。
(2)有人问直方图异常如何掌握?
A.红细胞直方图比较容易掌握,峰值左移观察血涂片,是否红细胞体积偏小(再结合MCH,可分析是否有色素含量减少)峰值左移观察血涂片,是否红细胞体积偏大(再结合MCH,可分析是否有色素含量增多)双峰时,也要观察血涂片,注意红细胞的特点。
B.白细胞直方图也不难掌握,正常情况下三分类血球分析仪打出的是"两峰一谷":第一个峰,细胞体积范围是35-98fl,代表占外周白细胞总数20-40%的成熟淋巴细胞第二个峰,细胞体积范围是150-450fl,代表占外周血臼细胞总数50-75%的嗜中性粒细胞细胞体积范围98-150fl,代表占外周血白细胞,嗜酸和嗜碱性粒细胞,因三者之和,也仅占外周血白细胞总数的10%左右,相对于成熟淋巴细胞和嗜中性粒细胞来说,比例很小,所在直方图上只能是个"谷"。如果白细胞直方图失态,不是"两峰一谷",而是单独的一个峰,而这个峰有恰恰位于原来的"谷"的位置上,那是急性非淋巴细胞性白血病的重要特征。如果这个单峰基本位于原来淋巴细胞的位置上,那是急性淋巴细胞性白血病的特征。如果正常的淋巴细胞峰变得很矮小,而原来嗜中性粒细胞变得又宽又高大,那是慢性粒细胞性白血病的特征。这些只要我们做血涂片观察，我想任何一位检验工作者都不会漏诊白血病。
C.血小板直方图的异常比较难掌握,因为血小板直方图的改变往往是干扰造成的，常见的干扰有小红细胞,细胞碎片,微小的血凝块,血小板聚集等。
如小红细胞增多时,如严重的缺铁性贫血,这些体积小子20fl的小红细胞就可能进入血小板的计数范围之中,使血小板计数假性增高。同时，血小板直方图出现尾部曲线上升的形态。
如细胞碎片,如果碎片大于红细胞体积界限的低值时,这些碎片会被计数为红细胞使红细胞计数假性增高,不会对血小板直方图产生影响。但如果细胞碎片小于20fl,将被计数为血小板,使血小板计数假性增高。同时,使血小板直方图前部曲线抬高。
如血小板凝块,少量小的凝块不会对血小板直方图有明显影响。大的血小板凝块,体积大于20fl,将被计数为血小板,使血小板计数假性增高。同时,使血小板直方图前部曲线抬高。
如血小板凝块,少量小的凝块不会对血小板直方图有明显影响。大的血小板凝块,体积大于20fl,不仅使血小板计数减少,即假性减低而且使血小板直方图尾部升高(类似于小红细胞对血小板直方图的干扰)。
如红细胞凝块,由于体积较大,不仅可以计数到红细胞数中,使红细胞计数假性增高，而且使血小板直方图整个曲线水平抬高,成为一条类似水平的曲线。
五分类血球分析仪由于采用的多种技术,它们显示的不是细胞体积的直方图,而是三维状态的散点图。正常的血细胞在散点图上有其固定的位置和形态,如果散点图异常,也同样提示有异常细胞出现,同样应当进行血涂片检查。我前面已经说过,不论生产厂家采取什么样的技术和措施,仪器如何升级换代,都代替不了人工显微镜下对细胞形态的真实观察。
(二)尿沉渣检查的标准化
1.尿沉渣检查的指征:
美国临床检验标准委员会(NCCLS)规定凡有下述情况的应进行显微镜检验:
(A)医生提出镜检要求的
(B)检验科规定的患者(如泌尿科、肾病科、糖尿病，应用免疫抑制剂及妊娠妇女)
(C)任何一项理化检验结果异常的。
我国检验学会规定凡红细胞,白细胞,蛋白和亚硝酸盐四项干化学检查中有其中任何一项不正常者都应进行显微镜检查，并以显微镜检查报告为准。
那也就是说,只有干化学法检测尿液红细胸,白细胞,蛋白和亚硝酸盐四项检查均阴性(正常)时,检验人员可不做显微镜检查(复查)。
2.尿沉渣检查的标准化:
尿沉渣显微镜检查是尿液分析中的重要组成成分,其在泌尿系统疾病中的诊断价值已被临床医生所肯定。但是,长期以来,因尿沉渣成分复杂,检查难度大,又缺乏标准化和有效的质量控制措施,使得这项检查对临床诊断的意义大打折扣。
1995年NCCLS,JCCLS以及1997年欧洲尿分析协作组都先后制定文件,规范尿沉渣的检查方法。这些文件虽然具体内容上略有不同,但都强调:
(1)检测尿液要新鲜,要使用带刻度,尖底离心管
(2)尿标本必须定量,按标准化要求定时,定速离心沉淀,留置离心尿要一致
(3)尿沉渣必须定量检测,经显微镜下确证
(4)用专用术语和单位体积定量报告结果。
1997年第二版《全国临床检验操作规程》中是这样规定的:
(1)标本采集:晨尿,1小时内送检
(2)标本处理:10ml,加入带刻度的离心管(没有具体规定非是尖底不可,但最好用尖底管)500g,离心5分钟,留取尿沉渣0.2ml
(3)样品制作:0.2ml尿沉渣滴在干燥清洁的玻片上,加盖18mm×18mm的盖玻片
(4)检查方法:湿片法,不染色,普通光镜,计数细胞要观察10个高倍视野,计数管型要观察20个低倍视野
(5)结果报告:细胞以每高倍视野最低-最高数,管型以每低倍视野平均数。
标准化之中非常重要的就是定量报告的方式。
3.尿沉渣板定量分析:
A.器材
(a)尿沉渣离心管:带有刻度,可放10ml尿液,管底有一个"凸凸头"。当倾倒离心后的上清尿液时,"凸凸头"里的尿沉渣不会流出,大约容量为10ml。
(b)尿沉渣定量分析板:每块分析板上有10个均一厚度(0.1mm)计数池,每个计数池内有固定体积(1μl)的计数区(十数区内划分10个中方格,每个中方格又划分为9个小方格)。
B.操作
(a)取均匀混合尿10ml于离心管中,1500r/min,离心5min,倒去上清尿液。
(b)取1小滴(15-20μl)尿沉渣冲入定量分析极其中一个计数池中,然后用低倍镜观察,高倍镜计数,计数在1μl计数区内红细胞,白细胞,上皮细胞和各类管型的数量。
C.参考值范围
非常不统一。
传统的尿沉渣检查是放大400倍,观察10个视野,如果每离倍镜视野红细胞超过3个,为镜下血尿,臼细胞超过5个为白细胞尿。
使用尿沉渣检查,一般红细胞少于8个/μl,但也有报告正常参考范围是<5个/μl,儿童少于14/μl白细胞<10/μl。
对于尿沉渣的检查,建仪使用定量板法报告,而尽量不使用载玻片报告法,见表4。
从上表也可以看出,定量板法检查的重复性明显优于载玻片法。
4.尿沉渣定量分析仪
UF-100尿沉渣分析仪是按照血球计数仪的计数原理进行尿液中细胞计数的,而DiaSysR/S2003尿沉渣定量分析工作站是根据流动计数池计数的,它们的计数方法不同,到底两者结果相关性如何,还缺乏大规模,多中心的研究。
301医院丛玉隆等人对400例正常人的尿液标本分别用四种方法进行定量计数,我用表5的形式归纳如下:
镇江医学院顾可梁等人用UF-100尿沉渣分析仪对83例健康人进行了检查,报告参考范围是:红细胞,男性0-12/μl,女性0-19/μl白细胞,男性O-11/μl,女性0-32/μl发现男,女之间有明显不同。
上述两个调查值表明使用UF-100尿沉渣分析仪检测的结果要比传统离心法显微镜尿沉渣板检查的结果要高。
在不能普及尿沉渣自动分析仪的情况下,我国应当尽快统一规定,采用尿沉渣板进行定量报告为标准方法并确定参考值范围。
