抗微管药物实验
抗微管药物实验主要用于(1)寻找新抗癌药(2)研究抗癌药作用机制。
实验方法原理 | 微管蛋白溶液在0~4℃是无色透明溶液,当温度升高,或37℃保温时,管蛋白聚合生成微管,随之溶液的浊度增加,吸收度(OD)上升,这可用分光光度计,在 350 nm 波长测得,根据所测得的OD值对保温时间作图,绘出“S”型聚合曲线。相反,将已聚合的微管溶液放水浴。亦可以测定其解聚曲线。 |
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实验材料 | |
试剂、试剂盒 | |
仪器、耗材 | |
实验步骤 | 一、 微管蛋白的制备
3. 取材 4. 操作
二、微光蛋白活性的测定 1. MES缓冲液,配制方法同上。 2. ATP(或GTP)溶液100 mmol/L的原液,试验当天配制,试验前加入到微管溶液, 终浓度为1 mmol/L。 (1)取出冷冻的微管蛋白溶液,快速用常温水冲其瓶壁,使之融化。
(7)以所测得的OD值对保温时间作图可以得到一个正“S”型的聚合曲线,和倒“S”型解聚 曲线(图65-4)可看到,37℃保温开始1~2 min,是一暂短的潜伏期,然后曲线呈指数上升。
三、 抗微管药物的筛选 1. 具体操作 (2)一般从0.1 mmol/L 浓度开始测定药物对微管的影响的实验,如发现有明显的作用,可以进一步稀释3~5个浓度进行测量。
(4)具体试验方法,步骤同前(微管蛋白聚合活性的测定)。 (1)抑制微管聚合作用的药物举例:秋水仙碱(图65-6)。抑制率计箅,取37℃保温 20 min 时,各管的“OD”按以下公式计箅:
(2)促进聚合,抑制解聚的药物举例:紫杉醇(图65-7)。由图65-7看出,加药后。 |
注意事项 | 1. 在制备微管蛋白的实验中,一定注意取材要新鲜,争取在处死动物后1 h 内开始实验。不能用低温冷冻后的脑组织,否则收率不高,活性低。
4. pH对微管体外聚合影响较大,在药物筛选时,注意药液的pH不能过高或太低,尽量使加入药液后,微管蛋白溶液pH不发生明显改变。
5. 取冷冻的微管蛋白溶液,快速用常温水冲洗瓶壁,使融化,放入冰浴,用冷MES缓冲液(不含GTP或 ATP)稀释至所需浓度(2~3 mg/ml),加入GTP 或 ATP至1.0 mmol/L 。
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其他 | 1. 抗微管类药物是通过作用于细胞微管而影响纺锤体形成,并抑制细胞有丝分裂的一类广谱化疗药。通过作用于细胞微管而影响纺锤体形成,并抑制细胞有丝分裂的一类广谱化疗药。目前常用的抗微管类药物主要有:紫杉醇、多西他赛、长春碱、长春新碱和长春瑞滨等。 2. 紫杉醇/多西他赛作用于肿瘤细胞后,可以促进肿瘤细胞内的微管聚合以及稳定已聚合的微管,导致细胞内大量微管聚集,进而干扰细胞各种功能,特别是使细胞停止分裂。长春碱/长春新碱等可以抑制肿瘤细胞内微管蛋白的聚合、抑制纺锤体微管的形成,使核分裂停滞于细胞分裂中期,从而抑制肿瘤细胞生长。 展开 |
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