| 实验步骤 |
一、材料
1. 培养基
含四环素或卡那霉素的 LB 培养基 或 加富 M9 基本培养基
LB 或 YT 培养基
含 5 mmol/L MgCl2 的 2 X YT 培养基
2. 专用设备
无菌牙签或接种针或玻璃毛细管（50 μl )
3. 载体和菌株
铺于琼脂或琼脂糖平板上的 M13 噬菌斑（制备上层琼脂或琼脂糖中的噬菌斑的方法）
大肠杆菌
F' 菌株，生长于琼脂平板上，克隆分离良好。（取适当菌株的主培养物在 M9 基本琼脂平板上划线，对抗生素抗性菌株，则在含适当抗生素的 LB
平板上划线，37℃ 培养 24~36 h。M13 噬菌体的单链 DNA 如果是用于作为寡核苷酸介导的突变则其应在含 dut 和 ung
基因突变的大肠杆菌中增殖。）
二、方法
1. 取带有 F' 质粒的大肠杆菌的一个新长成的单菌落接种 5 ml 加富培养基（对抗生素抗性菌株则用含适当抗生素的 LB 培养基），37℃ 温和振荡 12 h。
2. 取 0.1 ml 培养物接种 5 ml 含 5 mmol/L MgCl2 的 2 X YT 培养基，37℃ 剧烈振荡培养 2 h。
3. 将 5 ml 培养物用 45 ml 含 5 mmol/L MgCl2 的 2 X YT 培养基稀释，每支 1 ml 分装无菌试管（13 X 100 mm 或 17 X 100 mm), 按需增殖的噬菌斑的数量确定试管数，另再分装 2 支作为噬菌体生长的阴性和阳性对照。将这些试管放于一边，步骤 7 使用。
4. 每支 1 ml YT 或 LB 分装无菌试管（13 X 100 mm 或 17 X 100 mm), 按需增殖的噬菌斑的数量确定试管数，另再分装 2 支作为噬菌体生长的阴性和阳性对照。
5. 用无菌接种针蘸取噬菌斑表面，在 YT 或 LB培养基中漂洗，制备 M13 噬菌体稀释悬液。挑取一个蓝色噬菌斑作为噬菌体生长的阳性对照，在平板上挑取一处无噬菌斑的大肠杆菌层，作为阴性对照。
6. 悬液室温放置 1~2 h, 使噬菌体颗粒从琼脂中扩散出来。
7. 取 0.1 ml 噬菌体悬液（步骤 6) 感染 1 ml 大肠杆菌培养物（步骤 3) 用于分离病毒 DNA。37℃ 温和振荡培养 5 h。
8. 培养液转到一个无菌微量离心管中，最大转速室温离心 5 min, 不要搅动细菌沉淀， 上清转移至一个新的微量离心管中。
9. 取 0.1 ml 上清置于一个无菌微量离心管中。
10. 剩余的 1 ml 培养上清制备噬菌体单链 DNA。细菌沉淀用于制备双链 RF DNA。
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