M13 噬菌体单链 DNA 是从感染细胞分泌至周围培养液中的病毒颗粒中制备的，首先在高盐存在下，丝状病毒被聚乙二醇（PEG) 沉淀浓缩，然后用酚抽提释放单链 DNA，最后乙醇沉淀收集单链 DNA。本实验来源「分子克隆实验指南第三版」黄培堂等译。
| 实验方法原理 | M13 噬菌体单链 DNA 是从感染细胞分泌至周围培养液中的病毒颗粒中制备的，首先在高盐存在下，丝状病毒被聚乙二醇（PEG) 沉淀浓缩，然后用酚抽提释放单链 DNA，最后乙醇沉淀收集单链 DNA。 |
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| 实验材料 | M13 单链噬菌体载体感染 M13 噬菌体的大肠杆菌培养物未感染的大肠杆菌的培养 |
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| 试剂、试剂盒 | 氯仿乙醇酚聚乙二醇 8000乙酸钠蔗糖凝胶上样缓冲液TE |
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| 仪器、耗材 | 琼脂糖凝胶多管振荡器 |
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| 实验步骤 | 一、材料
1. 缓冲液和溶液
氯仿
乙醇
酚
聚乙二醇 8000 ( 20%，m/V，PEG 8000 ) 溶于 2.5 mol/L NaCl。
乙酸钠（3 mol/L, pH 5.2)
蔗糖凝胶上样缓冲液
TE ( pH 8.0)
2. 凝胶
琼脂糖凝胶（1.2%) 悬于 0.5 X TBE，含 0.5 μg/ml 溴化乙锭
3. 核酸和寡核苷酸
重组 DNA 的 M13 单链噬菌体载体
4. 专用设备
多管振荡器（可选）
5. 载体和菌株
感染 M13 噬菌体的大肠杆菌培养物
未感染的大肠杆菌的培养
二、方法
PEG 沉淀噬菌体颗粒
1. 分别将 1 ml 感染和未感染培养物加入两个微量离心管，以最大转速室温离心 5 min, 室温下，将上清分别转入两个新微量离心管。
2. 上清中加入 200 μl 溶于 2.5 mol/L NaCl 的 20% PEG，颠倒离心管数次混合溶液，温和振荡，室温放置 15 min。
3. 在微量离心机上，以最大转速 4℃ 离心 5 min，回收噬菌体颗粒沉淀。
4. 用连接于真空装置的一次性移液器头或装有橡皮球的长巴斯德吸管小心地吸去所有上清后，再离心 30 s，去除所有残存的上清。
酚抽提单链 DNA
5. 用 100 μl TE ( pH 8.0) 振荡重悬噬菌体颗粒沉淀。
使沉淀完全重悬的最好方法是用 TE 室温浸泡沉淀 15~30 min，接着低速振荡溶解沉淀。使噬菌体颗粒沉淀完全重悬对下一步用酚有效地抽提单链 DNA 非常重要，如果同时提取多个样品，则使用多管振荡器省时又省力。
6. 在沉淀悬液中加入100 μl 平衡酚，振荡 30 s 充分混合，室温放置 1 min，再振荡 30 s。
7. 在微量离心机上，以最大转速离心 3~5 min。在方便的前提下，尽可能多地将上层水相转移至一个新微量离心管。
为了便于分相，可加入 30 μl 硅润滑油。这一步骤有时可提高产量，但通常是不需要的。不要试图转移全部水相，当约 5 μl 水相留在界面时，制备的单链 DNA 更干净。
用一次酚抽制备的模板可用于大多数用途（包括 DNA 测序)，一般不需再进行酚抽。但是，如果在步骤 3 噬菌体沉淀污染有FEG/NBa 上清的组分，则会影响双脱氧测序反应的重现性，并使每个反应测定的可靠长度下降至 300 bp 或更少。特别注意去除微量离心管中的痕量上清可以避免这个问题。另外有些研究者还在步骤 6 离心分相前，在每个离心管中加入 100 μl 氯仿，再振荡混合；或同步骤 7 将水相转移到一个新的微量离心管，再用 100 μl 氯仿抽提水相一次，离心分相，将水相转移至一个新的微量离心管。
乙醇沉淀噬菌体 DNA
8. 存在 0.3 mol/L 乙酸钠的条件下，用标准的乙醇沉淀法回收 M13 DNA。短暂振荡混合后，室温放置 15~30 min 或 -20℃ 过夜。
转移至新离心管的酚抽水相可能会略浑，但加入乙酸钠溶液后应清亮。
沉淀单链 DNA 也可加入 300 μl 无水乙醇：3 mol/L 乙酸钠为 25:1 的混合物，然后室温放置 15 min。这个方法不需要分别加乙酸钠和乙醇，因而在许多单链 DNA 样品纯化时，可以加快操作步骤。M13 DNA 可以在乙醇中 -20℃ 存放数月。
9. 在微量离心机上以最大转速 4℃ 离心 10 min 回收单链噬菌体 DNA 沉淀。
10. 轻轻吸去上清，小心不要触动 DNA 沉淀（经常只是能在管壁上看到的一点模糊痕迹)，再离心 15 s，去除所有残留的上清。
11. 加 200 μl 70% 冷乙醇，以最大转速 4℃ 离心 5~10 min。立刻轻轻吸去上清。
重要：在这一步，沉淀粘在管壁上并不牢固，因而操作务必要既快又小心，以免 DNA 丢失。
12. 倒置开盖的离心管 10 min, 使所有残留的乙醇流出和蒸发。用 40 μl TE ( pH 8.0）溶解沉淀，37℃ 温育 5 min 以加速 DNA 溶解。DNA 溶液 -20℃ 保存。
单链 DNA 的产量通常是 5~10 μg/ml 原始感染培养物。
13. 数个样品的 DNA 浓度的估计可各取步骤 12 制备的 DNA 溶液 2 μl 加蔗糖凝胶加样缓冲液 1 μl 混合后加至含 0.5 X TBE 和 0.5 μg/ml 溴化乙锭的 1.2% 琼脂糖凝胶的加样孔。用不同量的已知浓度的 M13 DNA 作为对照。6 V/cm 电泳 1 h, 根据荧光光密度的强弱估计 DNA 的量。
采用染料标记引物的每套四个双脱氧测序反应中通常需要 2~3 μg 标准的 M13 噬菌体 DNA 制品。 |
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