苯并[α]芘测定方法介绍--乙酰化滤纸层析-荧光分光光度法
一、原理
苯并[α]芘简称BaP,易溶于咖啡因水溶液、环己烷、苯等有机溶剂中。将采集在玻璃纤维滤膜上的飘尘微粒,用环己烷在水浴上连续加热提取、浓缩,用乙酰化滤纸层析分离,BaP斑点用丙酮洗脱,最后用荧光分光光度计定量测定。
二、方法的适用范围
本方法适用于大气飘尘中BaP的测定。当采样体积为40m3时,最低检出浓度为0.002μg/100m3。
三、仪器
①采样体积不大于40m3。玻璃纤维滤膜使用前在350℃马弗炉内灼烧2h。
②荧光分光光度计。
③紫外分析仪:带365nm或254nm滤光片。
④磁力恒温搅拌器。
⑤立式离心机:3000r/min。
⑥索氏提取器:60ml。
⑦KD浓缩器。
⑧具塞玻璃刻度离心管:5ml。
⑨层析缸。
⑩玻璃毛细管:自制点样用。
①1/10万分析天平。
四、试剂
除另有说明外,分析时均使用分析纯试剂和蒸馏水,或同等纯度的水。
①BaP标准溶液的配制:称取5.00mg固体标准BaP于50ml容量瓶中(因BaP是强致癌物,为了减少污染,以少转移为好)用少量苯溶解后,加环己烷定容至标线。其浓度为100μg/ml。将此贮备液用环已烷稀释成10μg/ml,避光贮于冰箱中。建议最好购买商品标准溶液。
②乙酰化滤纸的制备:把15cm×30cm的层析滤纸15～20张,松松地卷成圆筒状,逐张放入1000ml高型烧杯中,杯壁与靠杯壁第一张纸间插入一根玻璃棒,杯中间放一枚玻璃熔封的电磁搅拌铁芯。在通风橱中,沿杯壁慢慢倒入乙酰化溶液(250ml乙酸酐,0.5ml硫酸以及750ml苯混合液),在磁力恒温搅拌器上保持50～60℃,连续反应6h。取出乙酰化滤纸,用自来水漂洗3～4次,再用蒸馏水漂洗2～3次,晾干。次日,用无水乙醇浸泡4h,取出乙酰化滤纸,晾干、展平、备用。
③环己烷:重蒸,用荧光分光光度计检查。在荧光激发波长367nm、狭缝10nm处,荧光发射狭缝2nm,波长405nm处无峰。
④丙酮:重蒸。
⑤乙醚。
⑥苯:重蒸。
⑦甲醇。
⑧乙酸酊。
⑨硫酸。
⑩无水硫酸钠。
⑪二甲基亚砜(DMSO):用前先用环己烷萃取两次,弃去环已烷后备用。
五、样品采集
采样前将超细玻璃纤维滤膜不重叠平放在马福炉内,在350℃下灼烧2h,置于干燥器中保存。然后按气溶胶的采样方法,连续采样24h采样完毕后,将玻璃纤维滤膜取下,尘面朝里折叠,黑纸包好,塑料袋密封后迅速送回实验室,在低温冰箱中-20℃以下保存,7d内萃取,萃取液30d内分析完毕。
六、步骤
1、样品萃取
将飘尘样品(玻璃纤维滤膜的尘面朝里折叠后)小心放进索氏提取器的渗滤管中(放时不要让滤膜堵塞回流管)。加入50ml环己烷,置于温度为99℃±1℃水浴中(水面以达到接收瓶高的2/3为宜)连续问流8h。
根据提取液颜色深浅,取全部或将提取液定容到50ml后,取部分置于KD浓缩器中,在70～75℃的水浴中减压浓缩至近干。浓缩管用苯洗三次,每次3～4滴,用氮气吹至0.05ml,以备纸层析用。
2、纸层析分离
在准备好的15cm×30cm乙酰化滤纸30cm长的下端3cm处,用铅笔轻轻地画一横线,两端各留出1.5cm,以2.4cm的间隔将标准BaP与样品浓缩液用玻璃毛细管交叉点样。点样斑点直径不要超过3～4mm。点样过程中用冷风吹干。每个浓缩管洗两次,每次用1滴苯,全部点在纸上。将点完样的层析滤纸挂在层析缸内架子上,加入展开剂(甲醇:乙醚蒸馏水=4:4:1(体积比)),直到纸下端浸入1cm为止。用透明胶纸密封,于暗室中展开2～16h(可根据工作安排,灵活选择展开时间)取出层析滤纸,在紫外分析仪下用铅笔圈出标准BaP斑点以及样品与其高度(R值)相同的紫蓝色斑点范围。
剪下用铅笔圈出的斑点,剪成小条,分别放入5ml离心管中,在105～110℃烘箱中烘10min(或在干燥器中晾干,也可在于净空气中晾干)在干燥器内冷却后,加入丙酮至标线。用手振荡1min后,以300r/min的速度离心2min。上清液留待测量用。
3、样品测定
将标准BaP斑点和样品斑点的丙酮洗脱液倒入1cm的石英池中,在激发、发射狭缝分别为10nm和2nm,激发波长367nm处,测其发射波长402、405、408nm处的荧光强度F。
七、计算
用窄基线法按下列公式计算出标准BaP和样品BaP的相对荧光强度F,以及气样中BaP的含量C(相对比较计算法):
式中:C——大气飘尘中BaP含量,μg/100m3;
M——标准BaP点样量,μg;
F标准、F样品——标准BaP和样品斑点的相对荧光强度;
V——大气飘尘样品体积,m3;
R——环己烷提取液总体积与浓缩时所取的环已烷提取液的体积之比值。
八、精密度和准确度
①在六个平行测定飘尘中的BaP浓度为0.685,0.654,0.679,0.700,0.696,0.698μg/100m3,变异系数为±2.5%;标准偏差为S=0.0174。
②三个加标飘尘回收率98%,95%,104%。
③飘尘中BaP本底浓度为0.347,0.441,0.398μg/100m3,加标准BaP 0.454μg。实际回收量为0.445,0.430,0.474μg/100m3,变异系数为±5.0%。
