Southern blot实验方法和操作步骤
第一天 (restriction enzyme digestion)
1.取待測的genomic DNA，用二次水稀釋10倍
(30μl的DNA 加270μlddH2O→ 300μl)
2.換算genomic DNA濃度(OD260)，再換算取10μg所需的體積。
3.取10μg DNA，用限制酵素EcoRI、BamHI各2μl切O/N，將total體積調成400μl。(最好用1.5mL eppendorf)
第二天 (precipitation with ethanol)
1.取酵素作用後的DNA 2μl run 0.8% Gel，確認DNA是否有切動。(成帶狀，RFLP)
2.若DNA有被切動，則進行酒精鹽沉澱法將DNA沉澱出來。
i.加入總體積1/10的3M NaOAc(40μl)
ii.再加入1μl的glycogen
iii.最後加入兩倍體積的100% EtOH(800μl)
iv.放入-20℃中一至二小時以上
Ps要搖晃均勻，否則會結冰
3.自冰箱中取出，離心13,000rpm，15 mins。
4.小心倒掉上清液，再用乾淨的擦手紙將多餘的水份去除（注意，勿將pellet移除。）亦可用風乾或加熱去除水分。PS.此步驟一定要確實將酒精完全除去，才不致影響電泳。
5.待水份完全蒸發，加入40μl TE buffer將DNA溶解於室溫O/N。
第三天 (electrophoresis & transfer)
1. 將40μl的DNA於55℃乾浴槽加熱溶解十分鐘，此時total體積濃縮成30μl左右。
2.等待體積濃縮之同時，製備150~170ml 1% agarose gel，倒到模子裡，
約10~12mm厚度。
3.濃縮後的DNA用loading dye(5μl)混合後，loading至well內。
4.將電源供應器之電壓值調至100 ~ 150 Volt供電。（視需要而調整，常用120 Volt，跑到gel的2/3處。）
5.將跑完電泳的gel放入Denaturating solution中作用45 mins。
6.接著再將gel換到Neutralizing buffer內中和30+15 mins。
7.中和之後的gel可利用傳統方法（毛細現象）或抽氣法將ssDNA轉漬到Hybond-N+ membrane上。
第四天 (pre-hybrid & hybridization)
1.將transfer完成的membrane用2X SSC沖洗，再用UV-light做cross-linking，放入烘箱內80℃固定2hours以上。
2.在固定的同時準備standard buffer並預溫至 hybridization的溫度。
3.將固定好的membrane放入預溫好的pre-hybridization buffer中，於hybridization的溫度中pre-hybrid半小時。
4.pre-hybrid完畢後，用合成好並Denature的probe（存在於pre-hybridization
buffer）置換先前的pre-hybridization buffer，以進行hybridization overnight。(＞16
hours)
第五天 (wash & detection)
Wash
1.首先將probe回收到50ml離心管中，並放入-20℃保存。
2. 將membrane放入post-hybridization wash buffer-1內，於室溫下wash 5 mins兩次。
3.之後用post-hybridization wash buffer-2於68℃ wash 15 mins兩次。
Detection
4.將wash後的membrane用detection washing buffer潤濕1~5 mins
5.用30ml 1X Blocking reagent solution浸泡30-40 mins，此步驟可以延長。
6.之後用20 ml antibody solution作用30 mins。
7.接著以detection washing buffer於室溫下wash 15 mins兩次。
8.隨後，取適量的detection buffer將membrane潤濕2~5 mins。
（這些步驟都要保持membrane的濕潤，不可使其乾掉，否則會影響壓片結果。）
9.接著用擦手紙由membrane背面將水吸略乾，將先前配製好的CSPD solution滴在投影片上，並使之均勻的在membrane正面分佈開，使其作用5 mins
10.取出membrane，將背面多餘的液體用擦手紙吸乾。此步驟需全乾，否則會
影響壓片的結果。
11.將membrane用保鮮膜包好後放入37℃暖房10min中以增強酵素呈色反應
12.取出membrane，於暗房內壓底片及顯影。
Ps. Probe washing：將membrane於ddH2O中rinse，於37∘C下，用Post-detection membrane
wash solution wash 15 mins兩次。之後用2X SSC短暫清洗，重新用pre-hybridize之後的步驟處理。
