southern印迹杂交的方法步骤
以哺乳动物基因组DNA为例，介绍Southern印迹杂交的基本步骤。
一、 待测核酸样品的制备
（一）制备待测DNA
基因组DNA是从动物组织（或）细胞制备。1.采用适当的化学试剂裂解细胞，或者用组织匀浆器研磨破碎组织中的细胞；2.用蛋白酶和RNA酶消化大部分蛋白质和RNA；3.用有机试剂（酚/氯仿）抽提方法去除蛋白质。
（二） DNA限制酶消化
基因组DNA很长，需要将其切割成大小不同的片段之后才能用于杂交分析，通常用限制酶消化DNA。一般选择一种限制酶来切割DNA分子，但有时为了某些特殊的目的，分别用不同的限制酶消化基因组DNA。切割DNA的条件可根据不同目的设定，有时可采用部分和充分消化相结合的方法获得一些具有交叉顺序的DNA片段。消化DNA后，加入EDTA，65℃加热灭活限制酶,样品即可直接进行电泳分离，必要时可进行乙醇沉淀，浓缩DNA样品后再进行电泳分离。
二、 琼脂糖凝胶电泳分离待测DNA样品
（一）基本原理
Southern印迹杂交是先将DNA样品(含不同大小的DNA片段)先按片段长短进行分离，然后进行杂交。这样可确定杂交靶分子的大小。因此，制备DNA样品后需要进行电泳分离。在恒定电压下，将DNA样品放在0.8～1.0%琼脂糖凝胶中进行电泳，标准的琼脂糖凝胶电泳可分辨70－80000bp的DNA片段，故可对DNA片段进行分离。但需要用不同的胶浓度来分辨这个范围内的不同的DNA片段。原则是分辨大片段的DNA需要用浓度较低的胶，分辨小片段的DNA则需要浓度较高的胶。经过一段时间电泳后，DNA按分子量大小在凝胶中形成许多条带，大小相同的分子处于同一条带位置。另外为了便于测定待测DNA分子量的大小或是所处的分子大小范围，往往同时在样品邻近的泳道中加入已知分子量的DNA样品即标准分子量DNA （DNA marker）进行电泳。DNA marker可以用放射性核素进行末端标记，通过这种方式，杂交后的标准分子量DNA也能显影出条带。
（二） 基本步骤
1. 制备琼脂糖凝胶，尽可能薄。DNA样品与上样缓冲液混匀，上样。推荐使用的靶基因的上样量见不同条件下上样本的使用指针比较表。一般而言，对地高辛杂交系统，所需DNA样品的浓度较低，每道加2.5-5μg人类基因组DNA；如果基因组比人类DNA更复杂（如植物DNA）则上样量可达10μg；每道上质粒DNA<1ng。
2. 分子质量标志物（DIG标记）上样。
3. 电泳，使DNA条带很好的分离。4. 评价靶DNA的质量。在电泳结束后，0.25-0.50μg/mlEB染色15-30min，紫外灯下观察凝胶。
三、电泳凝胶预处理
（一）原理
DNA样品在制备和电泳过程中始终保持双链结构。为了进行有效地实现Southern印迹转移，对电泳凝胶做预处理十分必要。分子量超过10kb的较大的DNA片段与较短的小分子量DNA相比，需要更长的转移时间。所以为了使DNA片段在合理的时间内从凝胶中移动出来，必须将最长的DNA片段控制在大约2kb以下。DNA的大片段必须被打成缺口以缩短其长度。因此，通常是将电泳凝胶浸泡在0.25mol/L 的HCl溶液短暂的脱嘌呤处理之后，移至于碱性溶液中浸泡，使DNA变性并断裂形成较短的单链DNA片段，再用中性pH的缓冲液中和凝胶中的缓冲液。这样，DNA片段经过碱变性作用，亦会使之保持单链状态而易于同探针分子发生杂交作用。
（二）基本步骤
1. 如果靶序列>5kb，则需进行脱嘌呤处理。
(1) 把凝胶浸在0.25mol/L HCl中，室温轻轻晃动，直到溴酚蓝从蓝变黄。
注意：处理人类基因组DNA≤10分钟；处理植物基因组DNA≤20分钟。
(2) 把凝胶浸在灭菌双蒸水中
2. 如果靶序列<5kb，则直接进行下面的步骤
(1) 把凝胶浸在变性液（0.5mol/L NaOH，1.5mol/L NaCl）中，室温2×15分钟，轻轻晃动。
(2) 把凝胶浸在灭菌双蒸水中
(3) 把凝胶浸在中和液中（0.5mol/L Tris-HCl，pH7.5，1.5mol/L NaCl），室温2×15分钟。
(4) 在20×SSC中平衡凝胶至少10分钟。
四、转膜
即将凝胶中的单链DNA片段转移到固相支持物上。而此过程最重要的是保持各DNA片段的相对位置不变。DNA是沿与凝胶平面垂直的方向移出并转移到膜上，因此，凝胶中的DNA片段虽然在碱变性过程已经变性成单链并已断裂，转移后各个DNA片段在膜上的相对位置与在凝胶中的相对位置仍然一样，故而称为印迹（blotting）。用于转膜的固相支持物有多种，包括硝酸纤维素膜（NC膜）、尼龙（Nylon）膜、化学活化膜和滤纸等，转膜时可根据不同需要选择不同的固相支持物用于杂交。其中常用的是NC膜和Nylon膜。各种膜的性能和使用情况比较见各种尼龙膜性能及使用情况比较表。
五、探针标记
用于Southern印迹杂交的探针可以是纯化的DNA片段或寡核苷酸片段。探针可以用放射性物质标记或用地高辛标记，放射性标记灵敏度高，效果好；地高辛标记没有半衰期，安全性好。人工合成的短寡核苷酸可以用T4多聚核苷酸激酶进行末端标记。探针标记的方法有随机引物法、切口平移法和末端标记法。
六、预杂交（prehybridizafion）
将固定于膜上的DNA片段与探针进行杂交之前，必须先进行一个预杂交的过程。因为能结合DNA片段的膜同样能够结合探针DNA，在进行杂交前，必须将膜上所有能与DNA结合的位点全部封闭，这就是预杂交的目的。预杂交是将转印后的滤膜置于一个浸泡在水浴摇床的封闭塑料袋中进行，袋中装有预杂交液，使预杂交液不断在膜上流动。预杂交液实际上就是不含探针的杂交液，可以自制或从公司购买，不同的杂交液配方相差较大，杂交温度也不同。但其中主要含有鲑鱼精子DNA（该DNA与哺乳动物的同源性极低，不会与DNA探针DNA杂交）、牛血清等，这些大分子可以封闭膜上所有非特异性吸附位点。具体步骤如下：
（一） 配制预杂交液：6XSSC，5XDenhardt’s试剂，0.5%SDS，50%(v/v)甲酰胺，ddH2O，100ug/ml鲑鱼精DNA变性后加入。注：1.每平方硝酸纤维素膜需预杂交液0.2ml。2.预杂交液制备时可用或不用poly(A)RNA。3.当使用32P标记的cDNA作探针时，可以在预杂交液或杂交液中加入poly(A)RNA以避免探针同真核生物DNA中普遍存在的富含胸腺嘧啶的序列结合。4.按照探针、靶基因和杂交液的特性确定合适的杂交温度（Thyb）。（如果使用标准杂交液，靶序列DNA GC含量为40%，则Thyb为42℃。）
（二）把预杂交液放在灭菌的塑料瓶中，在水浴中预热至杂交温度。
（三）将表面带有目的DNA的硝酸纤维素滤膜放入一个稍宽于滤膜的塑料袋，用5-10ml2×SSC浸湿滤膜。
（四）将鲑鱼精DNA置沸水浴中10min，迅速置冰上冷却1-2min，使DNA变性。
（五）从塑料袋中除净2×SSC，加入预杂交液，按每平方滤膜加0.2ml。
（六）加入变性的鲑鱼精DNA置终浓度200μg/ml。
（七）尽可能除净袋中的空气，用热封口器封住袋口，上下颠倒数次以使其混匀，置于42℃水浴中温育4h.
七、Southern杂交
（一）原理
转印后的滤膜在预杂交液中温育4-6h，即可加入标记的探针DNA（探针DNA预先经加热变性成为单链DNA分子），即可进行杂交反应。杂交是在相对高离子强度的缓冲盐溶液中进行。杂交过夜，然后在较高温度下用盐溶液洗膜。离子强度越低，温度越高，杂交的严格程度越高，也就是说，只有探针和待测顺序之间有非常高的同源性时，才能在低盐高温的杂交条件下结合。
（二） 步骤
1.将标记的DNA探针置沸水浴10min，迅速置冰上冷却1-2min，使DNA变性。
2.从水浴中取出含有滤膜和预杂交液的塑料袋，剪开一角，将变性的DNA探针加到预杂交液中。
3.尽可能除取袋中的空气，封住袋口，滞留在袋中的气泡要尽可能地少，为避免同位素污染水浴，将封好的杂交袋再封入另一个未污染的塑料袋内。
4.置42℃水浴温育过夜（至少18h）。
八、洗膜
取出NC膜，在2XSSC溶液中漂洗5min，然后按照下列条件洗膜：2×SSC/0.1%SDS，42℃，10min，1S×SCC/0.1%SDS，42℃，10min，0.5S×SCC/0.1%SDS，42℃，10min，0.2×SSC/0.1%SDS，56℃，10min，0.1×SSC/0.1%SDS， 56℃，10min。采用核素标记的探针或发光剂标记的探针进行杂交还需注意的关键一步就是洗膜。在洗膜过程中，要不断振荡，不断用放射性检测仪探测膜上的放射强度。当放射强度指示数值较环境背景高1-2倍时，即停止洗膜。洗完的膜浸入2×SSC中2min，取出膜，用滤纸吸干膜表面的水分，并用保鲜膜包裹。注意保鲜膜与NC膜之间不能有气泡。
九、放射性自显影检测
（一）将滤膜正面向上，放入暗盒中（加双侧增感屏）。
（二）在暗室内，将2张X光底片放入曝光暗盒，并用透明胶代固定，合上暗盒。
（三）将暗盒置-70℃低温冰箱中使滤膜对X光底片曝光（根据信号强弱决定曝光时间，一般在1-3天）。
（四）从冰箱中取出暗盒，置室温1-2h，使其温度上升至室温，然后冲洗X光底片（洗片时先洗一张，若感光偏弱，则在多加两天曝光时间，再洗第二张片子）。（注：注意同位素的安全使用）
