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4种抗真菌药物的体外敏感性监测

2021.4.26

[摘要]

目的：

　　研究氟康唑、伊曲康唑、两性霉素B、5-氟胞嘧啶对948株真菌的体外抗菌活性。方法：真菌收集自2004年1月至2005年4月于北京协和医院住院患者提供的标本。分别采用酵母菌纸片扩散法敏感试验，Mueller-Hinton琼脂中补充2％葡萄糖和0.5mg／L美蓝，其他操作类似于美国国家临床实验室标准委员会M2-A6细菌药敏试验法；以及ATB? FUNGUS 2敏感试验两种方法。结果：白念珠菌最常见，占59％，其次为热带念珠菌占15％，光滑念珠菌占13％，克柔念珠菌占2％，烟曲霉占2％和近平滑念珠菌占2％、四种药物对白念珠菌、热带念珠菌和近平滑念珠菌有较高的抗菌活性。结论：抗真菌药的类型不同，对不同种真菌的体外抗菌活性有较大的差异，伊曲康唑和氟康唑对所研究的酵母菌：白念珠菌、热带念珠菌和近平滑念珠菌有较好的体外抗菌活性。

[关键词]

　　抗真菌药；微生物敏感试验；真菌

　　真菌感染已成为白血病，淋巴瘤，免疫抑制，长期使用广谱抗生素，中心静脉插管，中性粒细胞减少，? 烧伤，低体重的早产儿，高APACHEⅡ积分，血液透析，骨髓或器官移植，胃肠道手术和机械通气等特殊人群的严重感染性疾病。过去临床对真菌感染的经验治疗主要选择三唑类利两性霉素B，但近10年真菌的种类发生了明显的变化，有高达77％的酵母菌菌血症是非白念珠菌引起的，它们对抗真菌药可以产生耐药性，酵母菌感染的治疗面临新的挑战_[1，2]，因此，对威胁生命的真菌感染的患者，进行真菌药敏试验非常重要。为调查真菌对氟康唑、伊曲康唑、两性霉素B、5-氟胞嘧啶的敏感性，我们采用纸片扩散法和ATB FUNGUS 2两种方法测试948株真菌对氟康唑、伊曲康唑、两性霉素B、5-氟胞嘧啶的敏感性。

材料与方法

一、菌株来源

　　从2004年1月至2005年4月北京协和医院患者临床血液、尿液、胸腹水、脑脊液和下呼吸道标本中分离出可能致病的948株真菌。见表1、2。采用ChromG A显色培养基鉴定白念珠菌、热带念珠菌、光滑念珠菌及克柔念珠菌，其他念珠菌采用VITEK YBC卡鉴定到种的水平。

表1? 948株17种真菌所占百分比

菌株	株数	（%）
白念珠菌	573	59
热带念珠菌	149	15
光滑念珠菌	126	13
克柔念珠菌	22	2
烟曲霉	22	2
近平滑念珠菌	21	2
葡萄牙念珠菌	11	1
黄曲霉	7	1
新型隐球菌	5	1
青霉属	4	0
土曲霉	2	0
季也蒙念珠菌	1	0
念珠菌属	1	0
无名念珠菌	1	0
镰刀霉	1	0
头状地霉	1	0
酿酒酵母	1	0

表2? 6种真菌在2004年-2005年的分离情况

真菌名	2004年1-12月	2005年1-4月
白念株菌	468	104
热带念珠菌	133	15
光滑念珠菌	95	28
克柔念珠菌	21	1
近平滑念珠菌	13	9
烟曲霉	20	2

二、抗真菌药

　　氟康唑，25μg／片，未开封的纸片-20℃保存，开封后冰箱保存4周。ATB FUNGUS 2试条，含有伊曲康唑、氟康唑、5-氟胞嘧啶和两性霉素B。

三、真菌药敏试验法

1．纸片扩散法敏感试验

　　采用2003年美国国家临床试验室标准委员会(NCCLS)建议的酵母菌纸片扩散法敏感试验指南，在Mueller-Hinton(MH)琼脂中补充2％葡萄糖和0.5mg／L美蓝_[3]，在1L MH琼脂中，加入0.1ml美蓝(methyleneblue，Merck BP 1973产品)贮存液(0.1g美蓝加20ml无菌水即为美蓝贮存液)和20g葡萄糖。高压15min，121℃灭菌，水浴至55℃倾入4mm厚平皿备用。敏感试验其他操作步骤，与标准的细菌纸片法药敏试验相似，酵母菌悬液用无菌盐水比浊至0.5号麦氏管浊度，酵母菌量约为1×106～5×106／ml

2．ATB FUNGUS 2酵母菌敏感试验

　　ATB FUNGUS 2试条包括16对凹形杯。第一对不含任何抗真菌剂，用作阳性生长对照。另外的15对包含不同浓度的4种抗真菌剂，用于测定最小抑菌浓度（MIC）。将准备好的待测酵母菌的悬浮液转移到培养基中，并接种到试条上。孵肓后，通过肉眼判读凹形杯中液体的生长情况，获得MIC。试验条采用手工接种用ATB电子移液管混匀ATB F2培养基，避免产生气泡，使用ATB电子移液管在每个凹形杯中加入135μl的ATB F2培养基(大约3×104酵母菌／毫升或4×104酵母菌／凹形杯)。将一个盖子放在试条上，把试条放入一个密闭容器或是—个装有吸潮纸的GENbox型广口瓶里，在有氧条件下35℃(±2℃)的环境中，念珠菌属要培养24小时(±2小时)，新型隐球菌要培养48小时(±6小时)。对念珠菌属来说，如果在生长质控指示的凹形杯中生长不充分，24小时培养后，很难或是不可能读出试条的MIC，这时要在同样的环境下再培养24小时。

四、药敏指控

　　采用白念珠菌ATCC90028氟康唑可接受的抑菌环直径范围为28-39mm

五、结果判读

1．纸片扩散法敏感试验

　　读取抑菌环直径近似到mm，在大约80％抑制区判读为测量边界。在抑菌圈边缘或内部的极微小菌落(<20=可忽略不计，采用BIOMIC电子自动阅读系统读取抑菌环直径(mm)，并自动换算出相应的最低抑菌浓度(MIC)值(mg／L)_[4]。氟康唑和5-氟胞嘧啶敏感性的解释标准见表3。

表3 氟康唑和5-氟胞嘧啶纸片扩散法的抑菌环直径和相应MIC的解释标准

抗真菌药	氟康唑	氟康唑	5-氟胞嘧啶
	抑菌圈直径/mm	MIC（mg.l/l）	MIC(mg.l/l)
敏感（S）	≥19	≤8	≤8
剂量依赖性敏感（SDD）	15-18	16-32	16-32
耐药（R）	≤14	≥64	≥64

2．ATB FUNGUS 2酵母菌敏感试验

　　通过肉眼判读或是使用ATB仪器自动判读来观察生长情况。为方便肉眼判读，把试条放在黑暗的背景下。对于每一个抗真菌制剂，从低浓度开始，与生长对照杯状凹比较，记录每一个杯状凹的生长得分见表4。对于两性霉素B，最小抑菌浓度(MIC)应该判断为省长完全受抑制的测试杯的浓度(即得分为“0”的测试杯)在杯状凹外围存在一个(或几个)散在的菌落或生长迹象，应记录为“1”分。对于氟康唑，伊曲康唑和5—氟胞嘧啶，鉴定可能存在拖尾生长，最小抑菌浓度(MIC)对应的测试杯得分可以是“2”，“1”，或是“0”分。且在杯状凹外围的生长迹象应记录为“0”或“1”分。_[5]
表4．凹形杯的生长与得分

定义	得分
和生长对照完全一样	4
比生长对照有轻微减少	3
比生长对照孔明显减少	2
非常微弱的生长	1
没有生长	0

六、数据分析

　　文中所得表格采用WHO耐药监测组提供的软件WHONET5.3分析所得。

结? 果

　　909株真菌对氟康唑、伊曲康唑、两性霉素B和5—氟胞嘧啶的药敏试验结果见表5。

　　菌株数<10株的菌种未参加分析，，表5显示采用纸片扩散法敏感试验结果：氟康唑对白念珠菌、热带念珠菌、光滑念珠菌、克柔念珠菌、近平滑念珠菌的敏感性为23．8％～100％。采用ATB FUNGUS 2敏感性检测结果：其中热带念珠菌的MIC50为0.125～l，MIC90为0.5～1.6。

　　四种药物对白念珠菌、热带念珠菌有较高的抗菌活性。氟康唑对光滑念珠菌有较低的抗菌活性，其MIC50和MIC90范围明显高于两性霉素B和伊曲康唑，两性霉素B和伊曲康唑比氟康唑对这2种念珠菌有较高的抗菌活性。且伊曲康唑和两性霉素B对烟曲霉有较高的体外抗菌活性。

表5? 6种真菌对抗真菌药物的体外敏感性

真菌名	株数	抗真菌药	耐药%	中介%	敏感%	MIC50	MIC90	MIC平均值	MIC范围
白念株菌	468	氟康唑*	0	1.1	98.9
104	氟康唑	7.7	0	92.3	0.5	4	0.702	0.25-256
104	伊曲康唑				0.125	0.5	0.195	0.016-8
103	两性霉素B				0.5	0.5	0.497	0.25-0.5
104	5-氟胞嘧啶	1.9	0	97.1	0.5	0.5	0.581	0.19-128
热带念珠菌	133	氟康唑*	0.8	0.8	98.5
15	氟康唑	6.7	6.7	86.7	1	16	1.382	0.25-128
15	伊曲康唑				0.125	1	0.239	0.125-4
15	两性霉素B				0.5	0.5	0.477	0.25-0.5
15	5-氟胞嘧啶	0	0	100	0.5	0.5	0.5	0.5-0.5
光滑念珠菌	95	氟康唑*	12.6	3.2	84.2
27	氟康唑	7.4	18.5	74.1	4	32	4.548	0.25-512
26	伊曲康唑				0.5	4	0.5	0.125-8
26	两性霉素B				0.5	0.5	0.462	0.016-1
28	5-氟胞嘧啶	0	3.6	96.4	0.5	0.5	0.443	0.032-32
克柔念珠菌	21	氟康唑*	57.1	19	23.8
1	氟康唑				64	64	64	64-64
1	伊曲康唑				0.5	0.5	0.5	0.5-0.5
1	两性霉素B				0.5	0.5	0.5	0.5-0.5
1	5-氟胞嘧啶				2	2	2	2-2
近平滑念株菌	13	氟康唑*	0	0	100
8	氟康唑				0.5	8	0.771	0.5-8
9	伊曲康唑				0.125	0.5	0.135	0.062-0.5
9	两性霉素B				0.5	0.5	0.429	0.125-0.5
9	5-氟胞嘧啶				0.5	0.5	0.355	0.023-0.5
烟曲霉	17	伊曲康唑				0.5	1.5	0.588	0.19-2
18	两性霉素B				0.25	6	0.379	0.006-64
15	5-氟胞嘧啶				1	64	2.014	0.032-64

讨论

　　本研究提示：氟康唑对白念珠菌、热带念珠菌和近平滑念珠闰有较高的抗菌活性。文献报道真菌血流感染自1980年的5.4％增加至1990年的9.9％，念珠菌菌血症的病死率为38％_[6]。在美国流行病学研究发现，白念珠菌过去是最常见的念珠菌病的病原菌，但近来检测结果提示白念珠菌仅为55％，非白念珠菌为45％_[6]对烟曲霉而言，伊曲康唑比两性霉素B有较低的MIC值，伊曲康唑对烟曲霉有较高的抗菌活性。对非白念珠菌中的光滑念珠菌和克柔念珠菌，伊曲康唑对光滑念珠菌的抗菌活性低于两性霉素B，氟康唑对这两种念珠菌显示出较高的耐药性，尤其对克柔念珠菌。本研究结果表明：抗真菌药的类型不同，对不同种真菌的体外抗菌活性有较大的差异，伊曲康唑和氟康唑对所研究的酵母菌：门念珠菌、热带念珠菌和近平滑念珠菌有较好的体外抗菌活性；伊曲康唑、两性霉素B对烟曲霉有较高的抗菌活性；氟康唑对克柔念珠菌和部分光滑念珠菌表现出较高的耐药性，但伊曲康唑试验株数较少，无法评估。

参考文献

1．徐英春，王澎，陈民钧．辉瑞公司全球多中心酵母菌敏感性监测结果[J]．中国抗感染化疗杂志，2003，3(3)：187—190

2．Wenzel R, Brewer TF, Butzler JP, et al. fungi, A guide to infection control in the hospital(2nd Edition),international society for infection diseases[M].Boston,MA.USA,BC Decker Inc Hamilton.London,2002,157-159

3．National Committee for Clinical Laboratory Standards.Method for antifungal disk diffusion susceptibility testing of yeasts;proposed guideline[S].NCCLS M44-P,2003,123：6

4．Berke I,Tierno PM Jr. Comparison of efficacy and costeffectiveness of BIOMIC video and Vitek antimicrobial susceptibility test systems for use in the clinical microbiology laboratory [J].J Clinical Microbiology,1996,34：1980-1984

5．徐英春，王澎，原英等.氟康唑和伏立康唑对酵母菌抗菌活性的研究[J].中国抗感染化疗杂志 2003，3（5）：277-279

6．Rangel-Frausto MS,Wiblin T, Blumberg HM,et al.National Epidemiology of Mycoses Survey.Variations in rates of Candida Bloodstream Infections due to candida species in Seven surgical ICUs and six Neonatal ICUs[J].Clin Infect Dis 1999,29：253-258

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