完整线粒体mtDNA提取神器SageHLS在测序合成的应用
有关线粒体DNA：
线粒体是一种存在于大多数细胞中的由两层膜包被的细胞器，细胞中制造能量的结构，是细胞进行有氧呼吸的主要场所。线粒体病是遗传缺陷引起线粒体异常，致使ATP合成障碍、能量来源不足等导致的一组异质性病变，又称为线粒体细胞病。常见的线粒体疾病有Leber遗传性视神经病变（LHON）、线粒体脑肌病合并乳酸血征及卒中发作（MELAS）综合征、肌阵挛性癫痫伴肌阵挛破裂红纤维(MERRF)综合征、母系遗传糖尿病伴耳聋综合征等，线粒体疾病发病率约为1:5000（约每5000人中1人发病）。不同物种的线粒体基因组（mtDNA）大小有差异，动物线粒体基因组DNA较小，约为15.7～19.5kb，人类的mtDNA大小为16.659Kb。
线粒体DNA测序现状&难点：
mtDNA的突变会产生多种与脑和肌肉组织能量缺陷相关的遗传因素。mtDNA突变的诊断在以下几个方面依然面临着巨大的挑战：
总量低：尽管每个哺乳动物细胞有成千上百个mtDNA（每个细胞约300-1000个mtDNA），但是mtDNA基因组非常小（16,659bp，环状），仅占细胞内总DNA含量的0.2%。
低拷贝数和分布特异性：对比核基因突变的高拷贝，线粒体蛋白突变通常在每个（杂合或纯合）细胞中只有1-2个拷贝，mtDNA突变仅存在于极小部分的mtDNA分子中。此外，与人类疾病相关的mtDNA突变的分布往往具有组织特异性。
同源核假基因干扰：mtDNA基因中存在一些核假基因，这些假基因与mtDNA的编码部分具有高度序列同源性。这些假基因的序列读取使mtDNA突变位点的检测更加复杂化。
使用SageHLS平台进行完整mtDNA富集
为了确保低丰度mtDNA突变的检测不受核假基因的干扰，许多研究人员采用传统的氯化铯密度梯度离心法来富集mtDNA，或在NGS二代测序前通过PCR富集特异性的mtDNA序列，该方法虽然是mtDNA富集的金标准，但是整个富集流程所需试剂多，操作繁琐且耗时。推出的SageHLS全自动大片段DNA回收仪展示了一种新的分离mtDNA的方法（如图1），提供与梯度离心相当的富集得率，且手工操作的时间显著低于密度梯度离心法。
图1：SageHLS一步法提取完整人源mtDNA，取代传统的氯化铯密度梯度离心分离
结果展示：
SageHLS只需通过一个步骤，就可富集得到mtDNA。整个工作流程完全自动化，仅包含1.25小时的提取和片段分离电泳，以及1.5小时的洗脱。提取结果由illumina和ONT两大测序平台进行测序分析后，结果显示（如图2），大部分的二代测序突变结果会在三代测序结果上证实。但是，部分三代测序测得的突变未在二代测序结果中检出。
图2：上部分是ONT MinION测序的结果，下图是illumina MiSeq测序的结果
结果表明：SageHLS可以用来富集完整的人源mtDNA，文中我们采用简单易分离的WBC（白细胞）作为上样样本，使用SageHLS进行mtDNA纯化的过程是完全自动化的，可获得与繁琐耗时的金标准——氯化铯密度梯度离心法同样纯度等级的mtDNA。SageHLS富集得到的mtDNA浓度和纯度完全符合Illumima测序平台对mtDNA样本的需求，同时也能对占比很低的罕见异质性的mtDNA变异位点进行检测。另外，随着单分子平台投入成本的降低（Oxford
Nanopore和 PacBio），我们的方法对于制备这些平台所需的mtDNA是很有用的，将有助于较大的插入、缺失和重排的检出。
